王利紅,張 偉

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

湖羊HPG軸組織中LRH-1表達(dá)定位分析

王利紅,張 偉

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

為深入了解肝受體類似物-1(Liver Receptor Homolog-1, LRH-1)蛋白在湖羊下丘腦-垂體-卵巢軸組織中的表達(dá)分布,本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)了湖羊母羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織中LRH-1的表達(dá).結(jié)果表明:LRH-1免疫陽性顆粒在下丘腦和垂體組織的分泌細(xì)胞、卵巢卵泡顆粒細(xì)胞、輸卵管黏膜上皮分泌細(xì)胞和子宮腺細(xì)胞中均有分布;隨湖羊發(fā)情周期的變化,下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織中LRH-1蛋白表達(dá)量差異顯著,除下丘腦組織在發(fā)情期與間情期間存在顯著差異(P<0.05)外,其他組織在各階段間均存在極顯著差異(P<0.01);發(fā)情后期,下丘腦和卵巢組織中LRH-1蛋白表達(dá)量相對(duì)最高;間情期,輸卵管組織中表達(dá)量相對(duì)最高;發(fā)情前期,垂體和子宮組織中表達(dá)量相對(duì)最高.結(jié)果顯示,LRH-1蛋白的表達(dá)與湖羊HPG軸各組織功能存在相關(guān)性.

湖羊;肝受體類似物-1;下丘腦-垂體-卵巢軸;免疫組化;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

肝受體類似物-1(Liver Receptor Homolog‐1,LRH‐1,也稱NR5A2)屬于NR5A或Ftz-F1核受體亞家族.LRH‐1自小鼠肝臟中克隆出來以后,已采用原位雜交、RT‐PCR、Northern雜交和免疫組化等方法證明LRH‐1 mRNA和LRH‐1蛋白在人、小鼠、羊等多種動(dòng)物的腦、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)的組織中存在,對(duì)動(dòng)物的胚胎發(fā)育、分化、膽固醇代謝、膽汁酸的動(dòng)態(tài)平衡以及類固醇激素生成等方面發(fā)揮著重要的作用[1-2].在湖羊組織中,已在腦、復(fù)胃、腸及生殖系統(tǒng)等組織中檢測(cè)到LRH‐1 mRNA的存在[3],但LRH‐1蛋白在湖羊組織細(xì)胞中的表達(dá)定位分布則尚未見相關(guān)報(bào)道.本研究采用免疫組織化學(xué)方法,對(duì)湖羊母羊下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamus Pituitary Gonadal Axis,HPG軸)的下丘腦、垂體和卵巢組織以及輸卵管、子宮組織進(jìn)行LRH‐1蛋白表達(dá)分布檢測(cè),并通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法探索這些組織中LRH‐1蛋白在發(fā)情周期4個(gè)階段(發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期)的表達(dá)量變化,以期深入研究湖羊LRH‐1的生理學(xué)作用與生殖功能間關(guān)系,為探尋綿羊新的生殖調(diào)控方法提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 從健康湖羊母羊群中隨機(jī)選取發(fā)情周期4個(gè)階段(發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期和發(fā)情前期)的實(shí)驗(yàn)樣本各3只,宰殺后迅速開腹,采集下丘腦、垂體和生殖系統(tǒng)組織樣各2份,1份用PBS清洗后在4%多聚甲醛中固定24 h,之后,制成石蠟組織切片,用于免疫組化檢測(cè);另1份存于液氮中用于ELISA檢測(cè).本研究所選湖羊樣本均來自江蘇西來原生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司.

1.2 主要試劑 APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)、DAB購(gòu)自武漢博士德公司;0.01mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液、復(fù)合消化液、DAB顯色試劑盒、水溶性封片劑、多聚體IgG‐HRP均購(gòu)自Boster公司;蘇木素染液,LRH‐1抗體(MAB4086)購(gòu)自Millipore公司;NR5A2 ELISA 試劑盒購(gòu)自GBD公司.

1.3 免疫組化染色 組織切片置于二甲苯中脫蠟,之后水化,抗原修復(fù),滴加5%BSA封閉液,滴加一抗、二抗孵育,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,蒸餾水沖洗,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、水溶性封片劑封片,顯微鏡觀察.

1.4 ELISA檢測(cè) 將組織樣勻漿處理,離心取上清液,之后,按ELISA試劑盒說明書操作,將50 μL樣品加入反應(yīng)孔中,37℃孵育1 h,洗滌后于各反應(yīng)孔中加酶標(biāo)抗體0.1 mL,37℃孵育1 h,洗滌后每孔加入50 μL底物液顯色,20~25℃15 min.加終止液50 μL,在ELISA檢測(cè)儀上,于450 nm處讀OD值.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 LRH‐1在湖羊下丘腦和垂體中的分布 在湖羊下丘腦組織中,LRH‐1免疫陽性顆粒在下丘腦的神經(jīng)分泌細(xì)胞中大量存在.在垂體組織中,則少數(shù)垂體分泌細(xì)胞中存在LRH‐1免疫陽性顆粒(圖1).

圖1 LRH-1在湖羊下丘腦和垂體組織中的分布

2.2 LRH‐1免疫陽性細(xì)胞在湖羊卵巢組織中的分布在卵巢組織中,LRH‐1免疫陽性顆粒在卵泡顆粒細(xì)胞中大量分布(圖2).

2.3 LRH‐1在湖羊輸卵管組織中的分布 LRH‐1免疫陽性顆粒在輸卵管黏膜上皮的部分分泌細(xì)胞中有分布(圖3).

2.4 LRH‐1免疫陽性細(xì)胞在湖羊子宮中的分布 在湖羊子宮腺細(xì)胞中,有少數(shù)細(xì)胞為L(zhǎng)RH‐1免疫陽性細(xì)胞 (圖4).

圖2 LRH-1免疫陽性細(xì)胞在卵巢卵泡上的分布

圖3 LRH-1免疫陽性細(xì)胞在輸卵管中的分布

圖4 LRH-1免疫陽性細(xì)胞在子宮中的分布

2.5 發(fā)情周期不同階段湖羊HPG軸組織中LRH‐1表達(dá)量檢測(cè) 采用ELISA方法,對(duì)發(fā)情周期不同階段的湖羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織樣進(jìn)行LRH‐1表達(dá)量檢測(cè),結(jié)果見表1.

從表1可看出,在所檢測(cè)的5個(gè)組織樣中,均有豐富的LRH‐1蛋白表達(dá),且隨湖羊發(fā)情周期階段的不同,表達(dá)量差異顯著(P<0.05).除下丘腦組織在發(fā)情期與間情期間存在顯著差異(P<0.05)外,其他階段均存在極顯著差異(P<0.01).從各組織中LRH‐1表達(dá)量變化趨勢(shì)看,下丘腦和卵巢組織中LRH‐1蛋白表達(dá)在發(fā)情后期最高;輸卵管組織中,則在發(fā)情后期蛋白表達(dá)量逐漸增加,在間情期時(shí)達(dá)最高值,此后表達(dá)量下降,至發(fā)情期時(shí)達(dá)最低值;垂體和子宮組織樣中LRH‐1蛋白表達(dá)量從發(fā)情期逐漸遞增,至發(fā)情前期時(shí)達(dá)最高值.

表1 湖羊發(fā)情周期不同階段HPG軸各組織中LRH-1表達(dá)ELISA檢測(cè)結(jié)果 pg/mL

3 討 論

下丘腦和垂體是動(dòng)物重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)和激素分泌器官,對(duì)于保持動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)平衡和穩(wěn)定、調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖周期活動(dòng)起著重要的作用.Higashiyama等[4]在小鼠腦組織的下丘腦弓狀核和丘腦室旁核區(qū)域檢測(cè)到LRH‐1陽性細(xì)胞,提示LRH‐1可能參與調(diào)節(jié)動(dòng)物采食活動(dòng)以及將下丘腦-垂體-腎上腺活動(dòng)的信息傳遞到大腦邊緣區(qū)的作用[5].本研究在湖羊下丘腦和垂體組織的分泌細(xì)胞中均檢測(cè)到LRH‐1免疫陽性顆粒,表明LRH‐1與湖羊下丘腦和垂體組織的激素合成分泌功能存在一定的相關(guān)性.從發(fā)情周期不同階段湖羊下丘腦和垂體組織中LRH‐1表達(dá)量變化趨勢(shì)看,LRH‐1表達(dá)量極高值分別出現(xiàn)在發(fā)情后期和發(fā)情前期,這種蛋白表達(dá)量變化趨勢(shì)與課題組前期研究中檢測(cè)到的LRH‐1 mRNA在下丘腦和垂體組織中最高表達(dá)量分別在發(fā)情后期和發(fā)情前期的結(jié)果相似[6],表明湖羊下丘腦和垂體組織中LRH‐1 mRNA和LRH表達(dá)趨勢(shì)具有相似性.湖羊下丘腦和垂體組織中LRH‐1的表達(dá)變化具體與哪些激素的分泌存在相關(guān)性,有待后續(xù)深入研究.

在動(dòng)物卵巢卵泡中,顆粒細(xì)胞給卵母細(xì)胞提供所需的能量和物質(zhì),控制著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng).已有相關(guān)報(bào)道證實(shí)在動(dòng)物卵巢中有大量的LRH‐1基因表達(dá),且表達(dá)主要集中在卵泡顆粒細(xì)胞和妊娠期的黃體細(xì)胞中[7],表明LRH‐1可能在這些細(xì)胞里調(diào)控SR‐BI和CYP19的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控雌激素的生物合成[8-10].Duggavathi等[11]對(duì)比敲除LRH‐1基因小鼠和正常小鼠卵巢上卵泡發(fā)育和排卵的研究結(jié)果顯示,敲除LRH‐1基因的小鼠卵巢上雖有卵泡發(fā)育,但未有卵泡破裂排卵,如采用超排處理,仍未見卵子排出的現(xiàn)象,表明該基因與動(dòng)物的卵泡發(fā)育及卵子成熟有關(guān).Higashiyama等[4]在小鼠卵巢中檢測(cè)到有較強(qiáng)的表達(dá)信號(hào),提示LRH‐1在動(dòng)物生殖機(jī)能方面具有重要調(diào)控作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因不僅參與調(diào)節(jié)動(dòng)物性腺中芳香化酶的表達(dá),并且還通過介導(dǎo)黃體3β-羥基脫氫酶II表達(dá)來促進(jìn)孕激素的合成[12].與其他相關(guān)報(bào)道相似,本研究在湖羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞中檢測(cè)到較強(qiáng)的LRH‐1免疫陽性顆粒,表明湖羊LRH‐1與顆粒細(xì)胞功能間存在相關(guān)性.輸卵管和子宮是配子運(yùn)行、成熟以及早期胚胎發(fā)育及著床的重要部位.前期研究工作結(jié)果已證實(shí),在湖羊輸卵管和子宮組織中存在LRH‐1 mRNA的表達(dá)[13],此次,通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到LRH‐1免疫陽性顆粒在湖羊輸卵管黏膜上皮的分泌細(xì)胞和子宮腺細(xì)胞中均有分布,提示LRH‐1與湖羊生殖道腺體的分泌功能存在一定的關(guān)系.眾所周知,當(dāng)母畜卵巢卵泡破裂排出卵子后,排卵處即開始形成黃體,在生殖激素的作用下,生殖道(輸卵管和子宮)內(nèi)環(huán)境發(fā)生孕向變化,上皮分泌細(xì)胞分泌功能逐漸增強(qiáng),為早期胚胎發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng),這一變化過程處于母畜的發(fā)情后期和間情期(即黃體期).本研究中,湖羊輸卵管及子宮中LRH‐1的表達(dá)量變化在發(fā)情期均相對(duì)最低,此后,表達(dá)量逐漸增加,這一變化正與母畜黃體期生殖道孕向變化相符,進(jìn)一步表明LRH‐1與湖羊生殖道分泌細(xì)胞的功能有關(guān).

4 結(jié) 論

LRH‐1在湖羊下丘腦、垂體、輸卵管和子宮組織的分泌細(xì)胞和卵巢卵泡的顆粒細(xì)胞中有分布,且LRH‐1表達(dá)量在發(fā)情周期4個(gè)階段的組織間存在顯著差異,提示LRH‐1與湖羊HPG軸功能以及生殖道內(nèi)環(huán)境變化有關(guān)聯(lián).

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A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-058

2017-04-21;

2017-08-13

江蘇省高校"青藍(lán)工程"培養(yǎng)對(duì)象項(xiàng)目(2014);江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院"鳳凰人才工程"培養(yǎng)對(duì)象項(xiàng)目(10434014001)

王利紅(1975-),女,山西人,副教授,博士,主要從事動(dòng)物遺傳繁育研究,E-mail:wanglihong345@126.com