孔 琳,嚴昌國

(延邊大學農學院,吉林 延吉 133000)

延邊黃牛PRKAG3基因的表達量與肉質性狀的相關性分析

孔 琳,嚴昌國*

(延邊大學農學院,吉林 延吉 133000)

實驗選取100頭6月齡延邊黃牛,采用RT-PCR方法檢測延邊黃牛PRKAG3 基因在不同部位肌肉和不同器官中的表達量差異,進行PRKAG3基因表達量與肉質性狀的相關性分析.結果表明:PRKAG3基因在背最長肌的表達量最高,且表達量隨著體重的增加而增加,在600 kg時的表達量顯著高于300、400、500 kg時的表達量(P<0.05);PRKAG3基因在心臟中的表達量顯著高于肝、脾、肺、腎中的表達量(P<0.05);與胴體性狀間的相關性分析顯示,PRKAG3基因的表達量與屠宰率呈負相關,與眼肌面積和大理石花紋呈正相關,與背膘厚相關性不大;與肉質性狀間的相關性分析顯示,PRKAG3基因的表達量與pH、亮度、紅色度、黃色度呈負相關,與系水力、嫩度、蒸煮損失、彩色度、色相角呈正相關.由此可見,PRKAG3基因可以作為提高肉質性狀的候選基因.

延邊黃牛;RT-PCR;PRKAG3基因;肉質性狀

牛肉風味獨特、營養(yǎng)豐富,優(yōu)質高檔牛肉作為牛肉中的精品已經成為人們的消費時尚.對肉牛的育種改良一直是科研人員的工作重點.隨著分子遺傳學和分子生物技術的不斷發(fā)展,分子遺傳標記及其檢測技術在牛的育種過程中高效而精確地選擇了目標基因.PRKAG3(The Protein Kinase Adenosine Monophosphate-Activated γ3-subunit)基因是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)調節(jié)亞基γ3的基因,主要在骨骼肌中表達[1].Mahlapuu等[2]研究發(fā)現,PRKAG3基因是酵解型纖維AMPK的主要異構體,在氧化纖維中的表達量較低,在腦和一些白色脂肪組織中絲毫檢測不到.由此可見,PRKAG3基因在機體中的表達模式具有明顯的組織特異性,而且在骨骼肌中也具有獨特的生理功能.Ciobanu等[3]研究結果顯示,Val199-Ile199發(fā)生了突變,骨骼肌中的糖原含量會明顯降低. PRKAG3基因可能是一個影響肉質性狀的主效基因.李夢云等[4]實驗結果表明,PRKAG3基因在骨骼肌中的表達量較高,心臟中表達量較少,在腎和肝臟中沒有發(fā)現此基因的表達.可以推斷,PRKAG3基因在骨骼肌中具有獨特的生理功能,而且在年齡和品種上具有差異.本研究應用RT-PCR方法檢測延邊黃牛PRKAG3 基因在不同部位肌肉和不同器官中的表達量差異,對該基因和胴體性狀、肉質性狀的相關性進行分析,為進一步探討該基因作為延邊黃牛肉質風味候選基因提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康、無疾病、體重相近的100頭6月齡延邊黃牛犢牛(選自吉林省琿春市吉興牧業(yè)),入欄后適應期為15~20 d.實驗采用單因素完全隨機設計,所有實驗用牛嚴格按照實驗設計流程開展飼養(yǎng)直至32月齡屠宰.

1.2 樣品采集

1.2.1 活體取樣 在體重分別達到300、400、500、600 kg時在背最長肌第12~13肋骨間、深度達5 cm處用活體組織取樣鉗取樣.樣品在液氮中冷凍后運回實驗室-70℃保存.

1.2.2 血液樣品 延邊黃牛頸靜脈采血10 mL,應用ACD對血液抗凝.ACD∶血液=1∶6,4℃條件下運回實驗室,用于血液基因組DNA提取.

1.2.3 組織樣品 屠宰后,快速取心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、三角肌、半腱肌、股二頭肌、股三頭肌、腰大肌、背闊肌樣品各3份,并保持每頭牛同一組織間取樣部位一致.裝入消毒的一次性手套中,外包紗布,標記后立即存放在液氮中,然后-70℃保存,用于RNA的提取.

1.3 引物設計與合成 根據基因序列(GenBank:AF214520)、利用軟件合成PRKAG3引物.引物由上海博舜聯合實驗中心合成,各引物序列見表1.根據牛的PRKAG3基因序列(NC_007300.3)設計引物,對延邊黃牛PRKAG3基因的CDS區(qū)進行PCR擴增,利用Blast比對,在外顯子設計引物對延邊黃牛PRKAG3基因進行擴增,引物序列如表2.引物合成后為凍干狀態(tài),應在離心后加入滅菌的去離子水,制成10 μmol/L的溶液,混勻保存在4℃?zhèn)溆?

1.4 PCR擴增體系與程序 PCR反應體系為20 μL:10XEx Taq Buffer 2.0 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix1.6 μL,5p Primer 1 和 5p Primer 2 各 0.8 μL,5U Ex Taq 酶 0.2 μL,ddH2O 13.6 μL.

表1 PRKAG3基因中間片段擴增引物

表2 PRKAG3基因外顯子區(qū)域引物

在0.5 mL離心管內,依次加入上述各成分,瞬間離心混勻后,立即置于PCR儀中按下列程序進行反應:95℃變性5 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min.反應結束后,在2%的瓊脂糖凝膠板上點樣,取PCR擴增產物3.0 mL加入溴酚藍上樣緩沖液2.0 mL,130 V電泳20 min左右,然后在凝膠成像系統上拍照并保存.

1.5 RT-PCR擴增體系與程序 應用從背最長肌中提取的總RNA作為模板進行RT反應,反應總體積為10 μL:5XExscriptTMBuffer 2.0 μL,dNTP Mixtrue(10 mmol/L each)0.5 μL,Oligo dT(2.5 pmol/μL)0.5 μL,ExscriptTMRTase 0.25 μL,Total RNA 5.0 μL,RNase inhibitor 0.25 μL,RNase free dH2O 1.5 μL.在0.5 mL離心管內,依次加入各成分,瞬離混勻,按照42℃15 min,95℃2 min,4℃2 min進行RT反應.完成后立即-20℃保存.

1.6 目的片段與克隆載體的連接 將凝膠回收的目的片段與pMD-18T載體連接.連接反應體系4℃過夜.pMD-18T 載體 0.5 μL,目的片段 4.5 μL,Ligation Buffer 5.0 μL.

1.7 RNA的反轉錄 向無RNA酶的PCR管中,依次加入 5X PrimeScript Buffer(for Real Time)2.0 μL,Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL,Oligo dT Primer(50 mol/L)X10.5 μL,Random 6 Mers( 100 mol/L)X1 0.5 μL,Total RNA 500 ng,RNase free ddH2O加至10 μL.反轉錄程序設置為37℃ 15 min,85℃5 s,4℃Forever.1.8 Real-Time qPCR 檢測PRKAG3基因mRNA的表達 向96孔管中,按照以下體系依次加入2XSYBR Mix( 含 4.0 mmol/L Mg2+)7.0 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各 0.3 μL,ddH2O 3.9 μL,cDNA 1.0 μL.加好樣的八連管渦旋振蕩,瞬時離心,確保八連管底部無氣泡.反應體系:95℃ 3 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共40個循環(huán),采集熒光信號,Real Time 55℃ 30 s,81個循環(huán),熔解曲線,Melt Time 得到數據后,采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達量,β-actin 為內參.計算公式:

①用內參基因的 Ct 值歸一目標基因的 Ct 值:

ΔCt(test)=Ct(target, test)-Ct(ref, test)

ΔC(tcalibrator)=C(ttarget, calibrator)-C(tref,calibrator)

②用校準樣本的ΔCt值歸一試驗樣本的ΔCt:

ΔΔCt=ΔCt(test)-ΔCt(calibrator)

③計算表達水平比率:

2-ΔΔCt=表達量的比值

1.9 統計分析 運用SAS的GLM程序,配合模型進行最小二乘分析,進行PGKAG3基因與胴體性狀、肉質之間的相關性分析.

2 結果與分析

2.1 延邊黃牛PRKAG3基因在不同部位肌肉中的表達量差異 從表3中可以看出,PRKAG3基因在背最長肌中的表達量顯著高于其他肌肉的表達量(P<0.05),三角肌、半腱肌、股二頭肌、股三頭肌、腰大肌和背闊肌間表達量差異不顯著(P>0.05).延邊黃牛PRKAG3基因在背最長肌中的表達量隨著體重的增加而增加,600 kg時的表達量顯著高于300、400、500 kg(P<0.05),而300、400、500 kg間表達量差異不顯著(P>0.05).PRKAG3基因在心臟中的表達量顯著高于肝、脾、肺和腎(P<0.05),在肝、脾、肺和腎間表達量差異不顯著(P>0.05).

表3 延邊黃牛PGKAG3基因的表達量差異

2.2 延邊黃牛PRKAG3基因表達量與胴體性狀、肉品質的相關性分析 從表4中可以看出,PRKAG3基因的表達量與屠宰率呈負相關,與眼肌面積和大理石花紋呈正相關,與背膘厚相關性不大.PRKAG3基因的表達量與pH、亮度、紅色度、黃色度呈負相關,與系水力、嫩度、蒸煮損失、彩色度、色相角呈正相關.

表4 PGKAG3基因表達量與胴體性狀、肉品質的相關性分析

3 討 論

牛肉肉質是一個綜合性狀,受諸多外界和內在因素的共同影響.常規(guī)的肉質評定是通過測定理化性狀等眾多數值來客觀評定肉質的特性,這些理化指標包括pH、系水力、肌間脂肪含量、嫩度、肉色、蒸煮損失等.然而,這些理化性狀的測定存在著一定的系統誤差,而且在活體上無法直接進行操作,因此必須花費昂貴的同胞測驗才能順利的完成測定工作,具有較大的局限性.本實驗應用DNA分子標記進行輔助選擇,有效地避免了這些缺憾.

近些年來,隨著候選基因法在動物遺傳育種中的應用,可以在DNA水平上對肉質性狀的主效基因或者與肉質性狀緊密連鎖的基因進行控制,在動物的育種選擇中使其產肉量和肉質同步提高[5].如何有效地提高延邊黃牛肉的品質,已經成為熱議的話題[6].多數肉質性狀屬于數量性狀,由多基因控制.這些基因可能是調節(jié)基因,也可能是結構基因,或者是在生化代謝過程中影響性狀表達的基因.目前,基本確定其功效的有RN基因[7]、MyoD基因和PRKAG3基因.其中,PRKAG3基因是近年來確定的一個影響豬肉肉質的主效基因,在延邊黃牛中PRKAG3基因的研究甚少.本研究結果顯示,PRKAG3基因表達量隨著體重的增加而增加,在600 kg時的表達量顯著高于300、400、500 kg時的表達量;PRKAG3基因不僅在背最長肌中表達量較高,而且在心臟中的表達量也較高,在肝、脾、肺、腎及其他肌肉中表達量相對較少,是否與心臟的某些代償功能相關還有待于進一步研究.Lindahl等[8]報道,PRKAG3基因對豬肉最終的pH、色度等性狀存在一定的影響.Plastow[9]研究發(fā)現,PRKAG3基因對不同豬肉pH、亮度、紅度、黃度值均存在不同程度的影響.本研究發(fā)現,PRKAG3-6位點的多態(tài)性與延邊黃牛的pH有一定的相關性.以上研究表明,PRKAG3基因可以影響豬的pH,對牛肉的pH也有一定的影響.本研究中延邊黃牛均來自同一牧場且飼養(yǎng)環(huán)境和條件均相同,避免了牧場效應和環(huán)境因素對實驗結果的影響.

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[4] 李夢云, 陳代文, 張克英. PRKAG3基因在骨骼肌中的營養(yǎng)代謝調節(jié)作用及其對肉質的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報,2006, (2):33‐35.

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S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-048

2016-08-25;

2017-06-14

延邊黃牛高檔牛肉生產與脂肪沉積規(guī)律研究;吉林省科技廳國際合作處(20130413036GH)

孔琳(1983-),女,吉林延吉人,博士研究生,研究方向為動物遺傳育種與繁殖, E-mail:konglin777@126.com

*通訊作者:嚴昌國(1960-),男,朝鮮族,博士,教授,主要從事反芻動物營養(yǎng)研究及延邊黃牛研究,E-mail:ycg@ybu.edu.cn