張 鳳,曾倩暉,陶 虎,熊 琪,張 年,劉 洋,蔣思文*,陳明新*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064;2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,湖北 武漢 430070)

牛ACOX1基因過表達載體構(gòu)建及對脂肪沉積的初步研究

張 鳳1,2,曾倩暉2,陶 虎1,熊 琪1,張 年1,劉 洋1,蔣思文2*,陳明新1*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064;2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,湖北 武漢 430070)

實驗旨在闡明牛酰基輔酶A氧化酶1(Acyl-CoA Oxidase 1,ACOX1)在肌內(nèi)脂肪沉積過程中的作用,為優(yōu)質(zhì)肉牛品種培育提供理論依據(jù).首先擴增牛ACOX1基因的CDS序列,構(gòu)建ACOX1基因的過表達載體,然后將過表達載體轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞,利用油紅O染色技術(shù)檢測脂滴沉積情況,利用熒光定量PCR、Western blotting技術(shù)檢測成脂分化基因PPARγ及C/EBPα的表達量.BLAST分析及酶切鑒定結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了牛ACOX1基因的過表達載體;油紅O結(jié)果表明,過表達ACOX1基因抑制了3T3-L1細胞的脂滴沉積;熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果表明,過表達ACOX1基因顯著性抑制了C/EBPα的表達量而對PPARγ的表達量無顯著性影響.本研究結(jié)果顯示,ACOX1可能抑制肌內(nèi)脂肪沉積.

牛;ACOX1;過表達;脂肪沉積

肌內(nèi)脂肪含量直接影響肉質(zhì)的多汁性、嫩度和風味等感官性狀,是評價牛肉質(zhì)量等級、開展肉質(zhì)遺傳改良的重要依據(jù)[1-2].與其他部位相比,牛肌內(nèi)脂肪含有更高水平的多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸[3].雪花牛肉(肌內(nèi)脂肪呈現(xiàn)大理石花紋)的口感和營養(yǎng)價值都顯著高于普通牛肉,一直以來,如何增強肉牛肌內(nèi)脂肪沉積是肉牛產(chǎn)業(yè)關(guān)注的焦點.

?；o酶A氧化酶(Acyl-CoA Oxidase,ACOX)是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化第一步脫氫反應的限速酶,它特異性地催化長鏈和極長鏈脂肪酸脫氫氧化形成反式雙鍵的α, β-烯脂酰輔酶A[4].ACOX1基因在鼠、豬、人類和魚等物種中與脂肪酸代謝及甘油三酯沉積密切相關(guān)[4-10].在牛中,僅有2篇文獻報道ACOX1基因外顯子處存在的SNP位點與背膘厚及大理石花紋緊密相連[11-12],但在牛肌內(nèi)脂肪沉積方面的研究還未見報道.本研究采用基因工程技術(shù),構(gòu)建牛ACOX1基因的過表達載體,并轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細胞,初步研究其對脂肪沉積的作用,為深入開展ACOX1基因調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積功能研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料 組織樣品取自大別山黃牛肝臟組織;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自TransGen公司;限制性內(nèi)切酶KpnI和 XbaI、T4 DNA連接酶購自NEB公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)購自TaKaRa公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA/RNA/Protein三提試劑盒購自O(shè)mega公司;LipofectamineTM2 000購自Invitrogen公司;熒光染料 SYBRGreen I 購自 Bio-Rad 公司;油紅 O 干粉、胰島素、地塞米松和 IBMX 購自 Sigma 公司;4%多聚甲醛購自谷歌生物公司;DMEM/F-12 1∶1、PBS購自Hyclone公司;pCDNA3.1(+)表達載體由湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 牛ACOX1基因CDS(Coding sequence,編碼區(qū))序列擴增 根據(jù)NCBI中牛ACOX1基因mRNA已知序列,設(shè)計2對引物(F1/R1和F2/R2),其中F1/R1擴增的片段包含且大于CDS區(qū),引物序列見表1.為了保證過表達載體的表達效率,在翻譯起始位點上游加入Kozaka序列(GCCACC),同時在5′端加入KpnI的酶切位點及保護堿基(F2);為了方便在后續(xù)實驗中檢驗ACOX1的過表達效果,在下游引物的5′端加入外表達的flag標簽序列,同時添加XbaI的酶切位點及保護堿基(R2).以牛肝臟組織的cDNA為模板,F1/R1為引物,用高保真酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase進行第1輪的PCR擴增.預期擴增片段大小為2 099 bp,PCR擴 增 體 系:5XPrimeSTAR GXL Buffer 10 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL,上、下游引物各1 μL,模板 cDNA 1 μL,補 ddH2O 33 μL 至 50 μL.反應程序為:98℃預變性5 min;98℃變性10 s,60℃15 s,68℃延伸2 min,共30個循環(huán);最后68℃延伸5 min.然后以第1輪PCR產(chǎn)物為模板,F2/R2為引物,用高保真酶進行第2輪的PCR擴增,擴增體系及反應程序同第1輪.反應結(jié)束后將第2輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,對目的片段進行切割,利用膠回收試劑盒回收目的片段,具體操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行.

表1 PCR擴增引物序列

1.2.2 過表達載體的構(gòu)建及鑒定 將上述回收產(chǎn)物及pCDNA3.1(+)質(zhì)粒一并進行KpnI和XbaI雙酶切.其中,反應體系:KpnI/XbaI 各 1 μL,10XFastDigest Green Buffer 1.5 μL,回收產(chǎn)物或質(zhì)粒約 1 μg,補ddH2O至 30 μL.37℃酶切2~3 h后進行膠回收、純化,將回收的目的片段與載體片段用T4 連接酶按如下體系進行連接:目的片段 7 μL,載體片段 1 μL,T4 連接酶 1 μL,10XBuffer 1 μL.16℃ 過夜連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 中,12 h后挑陽性菌克隆檢測,并將驗證過的陽性菌測序.測序正確后去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定成功后置于-20℃?zhèn)溆?

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 3T3-L1細胞系由華中農(nóng)業(yè)大學教育部農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室保存,細胞培養(yǎng)基為DMEM/F-12 1∶1中加入10%的胎牛血清,培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2.待細胞培養(yǎng)至 80%的融合度,使用胰酶消化后均勻接種于6 孔板中. 每孔加入 10 μL 的 lipofectmin 2000和 4 μg ACOX1 表達質(zhì)粒的復合物于培養(yǎng)基中,48 h后提取細胞總RNA及總蛋白,具體操作步驟按照DNA/RNA/Protein三提試劑盒說明書進行.

1.2.4 熒光定量PCR和Western blotting 提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,各相應基因的定量引物(表2)進行相對熒光定量PCR.提取的總蛋白用于Western blotting檢測基因的蛋白表達量,具體操作步驟參考[13].

1.2.5 細胞的成脂誘導 細胞按 3X105個/孔接種至6孔板中,待細胞匯合后(此時標記為 0 d)用脂肪誘導培養(yǎng)基 DIM 誘導,步驟為前2 d加入脂肪細胞分化誘導培養(yǎng)基(1 μmol/L Dex(地塞米松)+ 10 μg/mL 胰島素 + 0.5 mmol/L IBMX(3- 異丁基-1-甲基黃嘌呤),2 d 后將培養(yǎng)基換成脂肪細胞分化維持培養(yǎng)基(10 μg/mL 胰島素),從第4 天至第8 天換成只含有 10% FBS的普通培養(yǎng)基,每隔1 d 換1次液,8 d 后進行油紅O染色.

表2 熒光定量PCR引物序列

1.2.6 油紅O染色 成脂誘導后的細胞首先經(jīng)PBS(pH=7.4)清洗2遍,加 4%多聚甲醛固定 0.5~1 h.之后移除多聚甲醛向細胞中加入油紅O染料(0.5 g油紅O干粉溶于100 mL異丙醇,再以3∶2的比例用dd H2O稀釋),37℃ 1 h.最后除去染料用PBS清洗2遍,顯微鏡下呈像.

2 結(jié)果與分析

2.1 牛ACOX1基因的生物信息學分析 對NCBI數(shù)據(jù)庫中牛ACOX1基因數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn),牛ACOX1基因位于19號染色體上[AC_000176.1(56300362..56321420)],基因組DNA序列全長為21 059 bp.mRNA序列(NM_001035289.3)全長為2 187 bp,其中CDS區(qū)域為1 983 bp;蛋白質(zhì)序列( NP_001030366.1)包含660個氨基酸.

2.2 牛ACOX1基因CDS區(qū)擴增 取大別山黃牛肝臟組織,提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板,通過2輪巢式PCR擴增ACOX1基因的CDS序列.如圖1所示,擴增的片段長度大小與預期大小相符合(1 983 bp).

圖1 牛ACOX1基因CDS區(qū)域擴增

2.3 ACOX1過表達載體的鑒定

2.3.1 測序鑒定 擴增的ACOX1 CDS區(qū)經(jīng)酶切、回收、純化等最終連接至pCDNA3.1(+)載體,轉(zhuǎn)化后得到的陽性克隆菌送去測序.測序結(jié)果與NCBI提交的序列經(jīng)BLAST(https∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome)進行比對,結(jié)果顯示二者序列一致(圖2),且?guī)е鴉lag標簽序列.

2.3.2 雙酶切鑒定 測序正確的陽性克隆菌經(jīng)擴大培養(yǎng)、去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒.測定質(zhì)粒濃度1 421.0 ng/μL,光密度OD260/280為1.95,滿足實驗需求.質(zhì)粒經(jīng)KpnI/XbaI雙酶切鑒定,酶切后釋放出預期結(jié)果大小的條帶(圖3).

2.4 ACOX1基因?qū)χ纬练e的影響 將ACOX1過表達載體及pCDNA3.1(+)空載體分別轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞.12 h后將普通細胞培養(yǎng)基換成脂肪誘導培養(yǎng)基DIM,8 d后對細胞進行油紅O染色.如圖4所示,與對照組相比,過表達ACOX1基因組的脂滴沉積量明顯減少.

2.5 ACOX1基因?qū)χ痉只瘶擞浕虮磉_量的影響 將ACOX1過表達載體及pCDNA3.1(+)空載體分別轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞,48 h后提取細胞總RNA、總蛋白,分別利用熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測脂肪分化標志基因PPARγ及C/EBPα的表達量.如圖5所示,過表達ACOX1基因顯著抑制了脂肪分化晚期基因C/EBPα的表達,對早期分化基因PPARγ無顯著影響.

3 討 論

3.1 ACOX1真核過表達載體的構(gòu)建 ACOX1是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化第1步脫氫反應的限速酶,與線粒體酰基輔酶A脫氫酶(ACADs)屬于同一種黃素酶超家族,并且由相同的祖基因進化而來[14].本研究依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中預測的牛ACOX1基因序列設(shè)計2對引物,利用高保真DNA聚合酶,通過巢式PCR擴增出完整CDS序列,然后利用一步法直接連接至真核過表達載體pCDNA3.1(+)上,通過測序及質(zhì)粒雙酶切鑒定確定ACOX1基因過表達載體構(gòu)建成功,此方法與以前的研究[15-16]先連中間載體(T載體)再連過表達載體相比,大大節(jié)約了成本,顯著提高了工作效率.另外,本研究在CDS 3′端區(qū)域添加了外源表達的flag標簽,flag標簽的表達與目的基因CDS的表達相同步,通過直接檢測flag標簽蛋白間接反映目的基因蛋白的表達情況,克服了目的基因無商業(yè)化抗體的難題.

圖2 ACOX1過表達質(zhì)粒測序比對結(jié)果

圖3 pCDNA-ACOX1質(zhì)粒雙酶切

圖4 油紅O染色結(jié)果

圖5 過表達ACOX1對PPARγ、C/EBPα表達量的影響

3.2 ACOX1基因?qū)χ纬练e的作用 本研究中將構(gòu)建的真核過表達載體pCDNA-ACOX1轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞,經(jīng)油紅O檢測發(fā)現(xiàn)過表達ACOX1基因抑制了脂滴形成,并顯著性抑制了成脂分化基因C/EBPα的表達.已有研究報道,小鼠ACOX1基因能夠改變脂肪酸代謝,影響甘油三酯的沉積[5-6],這與本研究結(jié)果相一致.也有研究發(fā)現(xiàn),牛ACOX1基因第13個外顯子處存在1個SNP位點,結(jié)果導致各標記基因型之間的背膘厚及大理石花紋指標存在顯著差異[11].Lee等[12]在ACOX1基因的CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)2個SNP位點,其中1個SNP位點與韓牛的肉質(zhì)等級和背膘厚緊密相連.以上研究結(jié)果表明,ACOX1基因確實與牛的肉質(zhì)性狀及脂肪組織形成有關(guān),但在牛肌內(nèi)脂肪沉積方面的作用并未報道.本研究通過在3T3-L1細胞中過表達ACOX1基因,經(jīng)油紅O檢測脂滴沉積及定量分析脂肪分化標志基因的表達情況,初步推斷ACOX1抑制脂肪形成,為深入研究ACOX1對肌內(nèi)脂肪沉積的功能奠定基礎(chǔ).

4 結(jié) 論

本實驗成功構(gòu)建了牛ACOX1基因的過表達載體,通過轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞,經(jīng)油紅O染色、熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測脂肪生成情況,初步發(fā)現(xiàn)ACOX1抑制脂肪生成,此結(jié)果為深入研究ACOX1基因?qū)ε＜?nèi)脂肪沉積的功能奠定基礎(chǔ).

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Construction of Over-expression Vector of Bovine ACOX1 Gene and Preliminary Study on Fat Deposition

ZHANG Feng1,2, ZENG Qian‐hui2, TAO Hu1, XIONG Qi1, ZHANG Nian1, LIU Yang1, JIANG Si‐wen2*,
CHEN Ming‐xin1*
(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Hubei Wuhan 430064, China;2. College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Hubei Wuhan 430070, China)

In order to elucidate the role of bovine acyl‐CoA oxidase 1 (ACOX1) in intramuscular fat deposition, and provide the theoretical basis for the cultivation of high quality beef cattle breeds, the CDS sequence of bovine ACOX1 gene was amplified and the over‐expression vector of ACOX1 was constructed firstly in this study, and then the over‐expression plasmid was transfeted into 3T3‐L1 cells. Lastly, the deposition of lipid droplets was detected by oil red O staining and the expression levels of PPARγ and C/EBPα were detected by fluorescence quantitative PCR and Western blotting. BLAST analysis and digestion identification showed that the over‐expression vector of bovine ACOX1 gene was successfully constructed; the results of oil red O staining showed that over‐expression of ACOX1 gene inhibited lipid droplet deposition in 3T3‐L1 cells;the results of fluorescence quantitative PCR and Western blotting showed that over‐expression of ACOX1 significantly inhibited C/EBPα expression but had no significant effect on the expression of PPARγ. These data suggest that ACOX1 may inhibit the deposition of intramuscular fat.

Bovine; ACOX1; Over‐expression; Fat deposition

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-042

2017-04-10;

2017-06-08

動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室開放課題(KLAEMB-2016-02);中國博士后科學基金面上資助(2017M610465);2016年度湖北省博士后創(chuàng)新崗位

張鳳(1988-),女,山東菏澤人,在站博士后,主要從事動物分子遺傳育種研究,E-mail: zhangfeng0130@163.com

*通訊作者:陳明新,研究員,主要從事動物遺傳育種工作,E-mail: 13807104106@163.com;蔣思文,教授,主要從事分子遺傳與動物育種研究,E-mail: jiangsiwen@mail.hzau.edu.cn