包桂蘭，王秀枝，梁鳳娟，劉佳，劉錚（.內(nèi)蒙古民族大學(xué)藥物化學(xué)與藥理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古通遼028000；2.烏蘭察布市中心醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古烏蘭察布02000）

蒙藥五味沙棘散對吸煙致小鼠肺部炎癥的改善作用及機制研究Δ

包桂蘭1＊，王秀枝1，2，梁鳳娟1，劉佳1，劉錚1（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)藥物化學(xué)與藥理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古通遼028000；2.烏蘭察布市中心醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

目的：研究蒙藥五味沙棘散（WSP）對吸煙所致小鼠肺部炎癥的改善作用及其機制。方法：將30只ICR小鼠隨機分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和WSP組（2 g/kg）。模型組和WSP組小鼠采用被動吸煙法復(fù)制肺部炎癥損傷模型，并于造模的同時每天ig相應(yīng)藥物1次，連續(xù)28 d。給藥結(jié)束后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠肺泡灌洗液（BALF）中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6和IL-10水平；蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察小鼠肺組織病理變化；Western blot法檢測小鼠肺組織中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、核因子κB p65（NF-κB p65）和磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白表達。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高（P＜0.01），肺組織發(fā)生明顯炎癥病變，肺組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，WSP組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05），肺組織炎癥損傷明顯改善，肺組織中p-p38 MAPK和p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：WSP可能通過阻斷p38 MAPK、NF-κB p65蛋白的磷酸化來抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的高表達，從而發(fā)揮其對吸煙所致小鼠肺部炎癥損傷的改善作用。

蒙藥；五味沙棘散；吸煙；炎癥；小鼠

五味沙棘散（WSP）又名沏其日甘-5，是由梔子、甘草、白葡萄干、木香、沙棘膏等5味蒙藥制成的一種蒙古族驗方，該方性平，為清肺祛痰之主方[1]。該方以沙棘為君藥，其味酸，性溫，具有止咳、祛痰、除巴達干（體液）功效；以具有排膿、祛痰功效的木香為輔，配以清肺熱、止咳、平喘的白葡萄干，清熱、止咳、祛痰的甘草，以及清血熱的梔子為佐使，具有清陳久性、潛伏性肺熱，止咳定喘和清熱祛痰之功效。其在臨床主要用于肺熱久嗽、喘促痰多、胸中滿悶、胸脅作痛和急、慢性支氣管炎見上述證候者[2-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，WSP可顯著改善慢性支氣管炎小鼠的炎性病變[4]。有研究表明，吸煙誘發(fā)的肺部損傷的本質(zhì)是誘發(fā)了炎癥反應(yīng)，而絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPKs）和核因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[5-6]，故若能降低MAPKs/NF-κB家族蛋白的磷酸化水平便可抑制促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，就可以緩解炎癥[7]。但目前有關(guān)WPS對肺部炎癥的改善作用及其作用機制的相關(guān)研究甚少。鑒于此，本研究采用被動吸煙法建立小鼠肺部損傷模型[8]，同時ig給予WSP，觀察WSP對肺損傷小鼠肺組織病理改變、炎性因子和MAPKs/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達及磷酸化的影響，探索WSP對吸煙刺激導(dǎo)致的小鼠肺部損傷的改善作用及可能的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

Mini-Protean3垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀（美國BioRad公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher科技公司）；ChemiScope 3300 Mini化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；IX53倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

WSP（由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院提供，批號：071213，規(guī)格：3 g/袋）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國Biolegend公司，批號：B192414、B198667、B183449、B183152）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（天津碧云天公司）；兔源細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、p38 MAPK，磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）一抗（美國CST公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

ICR小鼠30只，♂，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購于長春億斯實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2016-0003。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將30只ICR小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為空白組、模型組和WSP組（2.0 g/kg）[2]。WSP組小鼠ig 2.0 g/kg的WSP生理鹽水溶液，空白組和模型組給ig等體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。同時，于每天給藥2 h后，將模型組和WSP組小鼠放入煙室中進行煙熏，每天3次，每次30 min，每次間隔30 min，每次3支煙（每支煙含1 mg尼古丁、13 mg焦油），用以誘導(dǎo)小鼠肺損傷[8]。

2.2 標(biāo)本取材

末次吸煙24 h后，小鼠經(jīng)乙醚處死后取肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluids，BALF）進行炎癥因子檢測；對未取BALF的小鼠，將左肺置于4%多聚甲醛固定制備病理切片（0.2 mm），右肺置于－80℃條件下保存進行后續(xù)的蛋白檢測。

2.3 ELISA法檢測BALF中炎癥因子水平

取BALF，分別按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。

2.4 肺組織病理學(xué)觀察

取用4%多聚甲醛固定的左肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，置于倒置顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

2.5 Western blot法檢測小鼠肺組織中MAPKs/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達

將在肺組織加入混合裂解液中充分裂解，離心后取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，隨后加入上樣緩沖液在100℃沸水中變性，即得到總蛋白。按30 g蛋白每孔上樣，配制10%分離膠和5%濃縮膠，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后分別加入相應(yīng)一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。采用全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行掃膜，用凝膠圖像分析軟件對條帶進行相對定量分析，以目標(biāo)蛋白條帶的積分光密度值與內(nèi)參β-actin條帶的積分光密度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠BALF中炎癥因子水平的檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高（P＜0.01），IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，WSP組小鼠BALF中TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），IL-1β、IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠BALF中炎癥因子水平的測定結(jié)果（±s，n＝10，pg/mL）Tab1 Determination results of inflammatory factorlevels in BALF of mice in each group（±s，n＝10，pg/mL）

表1 各組小鼠BALF中炎癥因子水平的測定結(jié)果（±s，n＝10，pg/mL）Tab1 Determination results of inflammatory factorlevels in BALF of mice in each group（±s，n＝10，pg/mL）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

1.784±0.076 1.700±0.040 1.857±0.112空白組模型組WSP組46.480±4.618 199.745±31.853＊＊133.762±18.815#141.490±17.221 464.196±53.135＊＊387.365±16.003#430.605±30.417 1 558.250±215.788＊＊1 330.340±195.754

3.2 小鼠肺組織病理學(xué)改變的觀察結(jié)果

空白組小鼠肺組織中可見完整、清晰的肺泡及細(xì)小支氣管結(jié)構(gòu)；而模型組小鼠因吸煙刺激導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理學(xué)改變，包括肺泡壁毛細(xì)血管及細(xì)小支氣管壁血管擴張、充血，組織疏松水腫，有慢性炎癥細(xì)胞浸潤（主要為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），肺泡間隔明顯增寬；與模型組比較，WSP組小鼠肺組織的病理學(xué)改變明顯改善，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤、組織水腫及炎癥程度等均減輕，結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變的觀察結(jié)果（HE染色，×200）Fig1 Observation results of pathological changes in lung tissue of mice in each group（HE staining，×200）

3.3 小鼠肺組織中MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平的檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠肺組織中ERK1/2、p38 MAPK和NF-κB p65蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而p-ERK1/2、p-p38 MAPK和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，WSP組小鼠肺組織中p-NF-κB p65、p-p38 MAPK蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖2、表2。

圖2 各組小鼠肺組織中MAPK、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達測定的電泳圖Fig2 Electrophoresis charts of MAPK/NF-κB pathway related proteins in lung tissue of mice in each group

表2 各組小鼠肺組織中MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab2 Determination results of MAPK/NF-κB pathway related proteins in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠肺組織中MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab2 Determination results of MAPK/NF-κB pathway related proteins in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別空白組模型組WSP組p38 MAPK/β-actin 0.842±0.109 1.209±0.153 1.153±0.097 p-NF-κB p65/β-actin 2.940±0.136 4.341±0.095＊＊3.788±0.090#NF-κB p65/β-actin 1.013±0.023 1.256±0.059 1.157±0.031 p-ERK1/2/β-actin 1.856±0.052 2.752±0.024＊＊2.641±0.008 ERK1/2/β-actin 0.978±0.153 1.189±0.094 1.216±0.079 p-p38 MAPK/β-actin 0.205±0.037 0.483±0.057＊＊0.389±0.687#

4 討論

目前，由于環(huán)境因素外加生活規(guī)律的改變及其他因素所導(dǎo)致的慢性阻塞性肺?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、支氣管哮喘、肺癌等疾病的發(fā)病率、病死率呈全球性增加[9]。研究證實，COPD的主要致病因素是吸煙和大氣污染[10]，90%的肺癌均與吸煙有關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致體內(nèi)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達水平增高[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，被動吸煙28 d后，模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平與空白組比較顯著升高（P＜0.01）；WSP能有效抑制肺損傷小鼠BALF中TNF-α、IL-6炎癥因子的釋放（P＜0.05），而對IL-1β、IL-10無明顯作用（P＞0.05），這提示W(wǎng)SP對小鼠肺損傷的保護作用可能是通過抑制炎癥因子的表達實現(xiàn)的。

MAPK主要有3個亞族：ERK1/2、JNK和p38 MAPK[14]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路在許多生理病理過程中（如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等）都發(fā)揮著非常重要的作用[15]；而NF-κB是在炎癥、細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答以及腫瘤中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子[16]。研究證實，MAPKs/NF-κB通路在吸煙誘導(dǎo)的肺損傷病變過程中發(fā)揮著重要的作用。為闡明WSP是否會通過作用于這兩條通路的關(guān)鍵蛋白而發(fā)揮其抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的作用，本研究采用Western blot法對ERK1/2、p38 MAPK和NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平進行了考察。結(jié)果表明，WSP能明顯抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化，但對ERK的磷酸化無明顯作用，這提示W(wǎng)SP發(fā)揮抗炎作用的機制可能是通過阻斷MAPKs/NF-κB通路的激活。

綜上所述，WSP對吸煙誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷具有改善作用，其機制可能是通過抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化，進而阻斷MAPK/NF-κB通路的激活、抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達；但其更多的作用機制有待進一步闡明。

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Study on the Improvement Effect and Mechanism of Meng Medicine Wuwei Shaji Powder on Smoke-induced Lung Inflammation in Mice

BAO Guilan1，WANG Xiuzhi1，2，LIANG Fengjuan1，LIU Jia1，LIU Zheng1（1.Medicinal Chemistry and Pharmacology Institute，Inner Mongolia University for Nationalities，Inner Mongolia Tongliao，028000，China；2.Dept.of Pharmacy，Wulanchabu Central Hospital，Inner Mongolia Wulanchabu 012000，China）

OBJECTIVE：To study the improvement effect and mechanism of Meng medicine Wuwei Shaji powder（WSP）on smoke-induced lung inflammation injury in mice.METHODS：ICR mice were randomly divided into blank group（normal saline），model group（normal saline）and WSP group（2 g/kg）.Mice in model group and WSP group

passive smoking to induce model of lung inflammation injury，and intragastrically administrated relevant medicine when modeling，once a day，for 28 d.After administration，enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the tumor necrosis factor α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β），IL-6，IL-10 levels in bronchoalveolar lavage fluids（BALF）；the pathological changes of lung tissue were observed by optical microscope after hematoxylin-eosin staining；Western blot was adopted to detect the protein expressions of extracellular signal-regulated kinase（ERK1/2），phosphorylated ERK1/2（p-ERK1/2），p38 mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK），phosphorylated p38 MAPK（p-p38 MAPK），nuclear factor kappaB p65（NF-κB p65）and phosphorylated NF-κB p65（p-NF-κB p65）in lung tissue of mice.RESULTS：Compared with blank group，TNF-α，IL-1β，IL-6 levels in BALF in model group were obviously increased（P＜0.01）；lung tissue showed significant inflammatory lesions；and the protein expressions of p-ERK1/2，p-p38 MAPK，p-NF-κB p65 in lung tissue wereobviously increased（P＜0.01）.Compared with model group，TNF-α，IL-1β levels in BALF in WSP group were obviously decreased（P＜0.05）；inflammation injury in lung tissue was obviously improved；and protein expressions of p-p38 MAPK and p-NF-κB p65 in lung tissue were obviously decreased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：WSP shows improvement effect on smoke-induced lung inflammation injury in mice，which might be by blocking the p38 MAPK，NF-κB p65 phosphorycation to inhibit the high expression of inflammatory factors as TNF-α and IL-6.

Meng medicine；Wuwei Shaji powder；Smoke；Inflammation；Mice

R285

A

1001-0408（2017）31-4411-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.24

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項目（No.2016MS-0813）

＊教授，碩士生導(dǎo)師，碩士。研究方向：中蒙藥抗炎免疫藥理及心血管藥理學(xué)。E-mail：bgl-6891@163.com

2017-05-02

2017-08-10）

（編輯：林靜）