王霖玲，曾健梅，閻優(yōu)優(yōu)，張博，林能明，#（.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，杭州30006；.杭州市第一人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學附屬杭州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，杭州30006）

土木香乙酸乙酯提取物對人胰腺癌Capan-2細胞增殖的抑制作用及機制研究Δ

王霖玲1＊，曾健梅1，閻優(yōu)優(yōu)2，張博2，林能明1，2#（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，杭州310006；2.杭州市第一人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學附屬杭州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，杭州310006）

目的：研究土木香乙酸乙酯提取物（IHE）對人胰腺癌Capan-2細胞增殖的抑制作用及機制。方法：采用MTT法測定0、0.5、1、2、4、8 μg/mL的IHE作用48 h后細胞的增殖抑制率，克隆形成試驗觀察0、1、2 μg/mL的IHE作用1周后對細胞克隆形成的影響，Hoechst 33342染色法觀察0、2、4 μg/mL的IHE作用48 h后細胞核形態(tài)的變化，流式細胞術檢測0、4、8、16 μg/mL的IHE作用48 h后細胞的凋亡率，JC-1染色法觀察0、4、8、16 μg/mL的IHE作用24 h后細胞線粒體膜電位變化，Western blot法檢測0、4、8、16 μg/mL的IHE作用48 h后細胞線粒體凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Mcl-1和p53上調(diào)凋亡因子（PUMA）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）蛋白的表達。結(jié)果：2、4、8 μg/mL的IHE對細胞的增殖有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，半數(shù)抑制濃度為6.6 μg/mL；1、2 μg/mL的IHE可明顯抑制細胞的克隆形成；4 μg/mL的IHE可明顯造成細胞核固縮；8、16 μg/mL的IHE可明顯促進細胞凋亡，16μg/mL的IHE作用48 h后細胞凋亡率達到45.53%；16 μg/mL的IHE作用24 h后可引起82.47%的細胞線粒體膜電位下降；8 μg/mL的IHE可明顯下調(diào)細胞中Bcl-2、Mcl-1、PUMA、PARP蛋白表達，16 μg/mL的IHE可明顯下調(diào)細胞中Mcl-1、PUMA表達。結(jié)論：IHE可能通過引起細胞線粒體膜電位的下降，下調(diào)細胞中PUMA、Mcl-1蛋白的表達，引起細胞的凋亡，從而發(fā)揮其抑制人胰腺癌Capan-2細胞增殖的作用。

土木香；乙酸乙酯提取物；人胰腺癌Capan-2細胞；線粒體；細胞凋亡

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，預計在2030年將成為病死率第二高的惡性腫瘤[1]。由于大多數(shù)胰腺癌患者確診時已處于晚期，失去了手術機會，因此全身化療對于晚期胰腺癌患者來說顯得至關重要。盡管已有大量的研究致力于開發(fā)抗胰腺癌藥物，但胰腺癌患者的5年生存率在過去40年沒有明顯提高，仍低于5%[2]。我國中藥資源豐富，尚有許多具有抗腫瘤活性的天然藥物仍處于開發(fā)階段。土木香系菊科旋覆花屬植物，為多年生草本，其根供藥用，具有健胃、利尿和驅(qū)蟲的功效[3]。有研究表明，土木香的醇提取物中富含倍半萜內(nèi)酯類成分，而該類成分具有較強的抗腫瘤活性，對頭頸部鱗狀細胞癌、成膠質(zhì)細胞瘤、前列腺癌等具有明顯的細胞毒作用，但對胰腺癌的作用尚不明確[4]。本研究在獲得土木香醇提取物的基礎上[5-6]，進一步用乙酸乙酯萃取，得到了富含倍半萜內(nèi)酯類成分的土木香乙酸乙酯提取物（Inula helenium ethyl acetate extract，IHE），并探討IHE對人胰腺癌Capan-2細胞增殖的抑制作用及機制。

1 材料

1.1 儀器

FACSCantoⅡ型流式細胞儀（美國BD公司）；SpectraMax M3型全波長多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）；Microsystems CMS GmbH Am Friendensplatz 3型熒光顯微鏡（德國Leica公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、MTT（北京索萊寶科技有限公司）；熒光素異硫氰酸（FITC）標記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：6119908）；線粒體膜電位檢測試劑盒（美國SAB公司，批號：H16）；Hoeschst 33258染色液（碧云天生物技術研究所）；兔源B細胞白血病2（Bcl-2）、Bax、p53上調(diào)凋亡因子（PUMA）、髓樣細胞白血病1（Mcl-1）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）單克隆抗體和鼠源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗（武漢艾美捷科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

人胰腺癌Capan-2細胞購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，以含10%胎牛血清的RPMI 1640為培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 IHE的提取

將10.0 kg干燥的土木香根莖磨成粗粉，95%乙醇浸泡48 h，在室溫下用20倍的95%乙醇滲濾提取，真空濃縮，得到粗提物，約3.7 kg。將粗提物溶于1.5 L溫水中，并用3倍量的乙酸乙酯（3×1.5 L）萃取后，減壓蒸發(fā)，得到370.16 g的IHE（產(chǎn)率為3.7%）。用香草醛-硫酸比色法驗證IHE中含有生物活性化合物[3]。臨用時，用二甲基亞砜（DMSO）制備成高濃度母液后，用培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量濃度的IHE樣品溶液。

2.2 MTT法檢測細胞的增殖活性

收集對數(shù)生長期的Capan-2細胞，以離心半徑為13.5 cm、1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用培養(yǎng)基吹打成細胞懸液。然后分別以5×103個細胞/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別加入質(zhì)量濃度分別為0（空白對照，含DMSO的培養(yǎng)液，下同）、1、2、4、8 μg/mL的IHE。作用48 h后，棄培養(yǎng)液，加入50 μL的MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，離心去上清，每孔加入100 μL的DMSO，輕微振蕩使藍色結(jié)晶完全溶解。用全波長多功能酶標儀測每孔的光密度（OD），檢測波長為570 nm，參照波長為650 nm。試驗重復3次，每次設定5個平行復孔。細胞增殖抑制率（%）＝（1－給藥孔OD均值/空白對照孔OD均值）×100%。使用GraphPad Prism 5軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 克隆形成試驗檢測細胞的克隆形成能力

收集對數(shù)生長期的Capan-2細胞，計數(shù)，以500個細胞/孔的細胞密度接種于6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入0（空白對照）、1、2 μg/mL的IHE，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。取出，棄去原培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，然后用4%的多聚甲醛固定20 min，用吉姆薩（Giemsa）染液染色20 min。PBS洗干凈后晾干，拍照觀察細胞集落形成數(shù)量。試驗重復3次。

2.4 Hoechst 33342染色試驗觀察細胞核形態(tài)變化

收集對數(shù)生長期的Capan-2細胞，以2×104個細胞/孔的密度接種于24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入0（空白對照）、2、4 μg/mL的IHE，培養(yǎng)48 h。棄原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，然后每孔加入1 mL的4%多聚甲醛固定20 min。用PBS洗2遍后，再每孔加入300 μL的Hoechst 33342熒光染色液，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。取出后棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用熒光顯微鏡觀察細胞核變化，并拍照記錄。試驗重復3次。

2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞的凋亡情況

收集對數(shù)生長期的Capan-2細胞，以2×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中，將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入0（空白對照）、4、8、16 μg/mL的IHE培養(yǎng)48 h，收集上清培養(yǎng)液，用胰酶消化細胞并收集。之后加入300 μL的AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒中的緩沖液、5 μL的AnnexinⅤ-FITC染液，輕輕混勻后，于2～8℃避光條件下培養(yǎng)15 min。再加入10 μL的PI，輕輕混勻，于2～8℃避光條件下培養(yǎng)5 min后，流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率（%）。試驗重復3次。

2.6 JC-1染色法檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位

收集對數(shù)生長期的Capan-2細胞，以2×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中，將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入0（空白對照）、4、8、16 μg/mL的IHE培養(yǎng)24 h。收集上清培養(yǎng)液，用胰酶消化并收集細胞，然后用PBS洗2遍。每個樣本加入500 μL的JC-1工作液，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min后，用流式細胞儀檢測膜電位下降細胞比例。試驗重復3次。

2.7 Western blot法檢測細胞中凋亡相關蛋白的表達

收集對數(shù)生長期的Capan-2細胞，分別加入0（空白對照）、4、8、16 μg/mL的IHE培養(yǎng)48 h后，采用細胞裂解液收集細胞。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒測定總蛋白濃度，將樣品調(diào)整至等濃度后分裝，－80℃保存。以β-actin為內(nèi)參進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用50 g/L的脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的一抗（Bcl-2、Bax、Mcl-1、PUMA、PARP、β-actin），4℃孵育過夜，用緩沖液TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入HRP標記的二抗（1∶5 000），于室溫條件下培養(yǎng)2 h，再用緩沖液TBST洗膜3次，每次10 min。用超敏化學發(fā)光試劑顯影檢測，應用化學發(fā)光成像儀進行圖像采集，以目標蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。試驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 IHE對Capan-2細胞體外增殖的影響

IHE對細胞的增殖抑制率呈明顯的濃度依賴性增加。與0μg/mL比較，2、4、8 μg/mL的IHE作用48 h后細胞的增殖抑制率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中8 μg/mL的IHE對Capan-2的抑制率超過了80%。1、2、4、8 μg/mL的IHE作用48 h后，細胞的增殖抑制率分別為（7.01±1.84）%、（12.39±3.84）%、（38.23±3.30）%、（80.83±1.37）%（n＝3），IC50為6.6 μg/mL。

3.2 IHE對Capan-2細胞克隆形成的影響

克隆形成試驗也表明，不同質(zhì)量濃度IHE對Capan-2細胞的增殖有不同程度的抑制作用。經(jīng)Giemsa染色后可看出，IHE作用于細胞1周后，隨著其質(zhì)量濃度的增加，細胞集落形成數(shù)逐漸減少。與0 μg/mL比較，2 μg/mL的IHE作用1周后細胞集落形成數(shù)明顯減少（P＜0.01）。0、1、2 μg/mL的IHE作用1周后細胞集落形成數(shù)分別為（362.67±17.90）、（234.67±17.79）、（74.33±6.11）個（n＝3）。

3.3 IHE對Capan-2細胞核的影響

以2、4 μg/mL的IHE作用于細胞48 h后，細胞核固縮，熒光強度顯著增加，且4 μg/mL的IHE作用較2 μg/mL明顯。這一結(jié)果也證實了IHE能抑制Capan-2細胞的增殖，染色后熒光顯微圖見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度IHE作用48 h后細胞核的熒光顯微圖（Hoechst 33342染色，×40）Fig1 Fluorescence micrographs of nuclear morphology after 48 h with different mass concentrations of IHE（Hoechst 33342 staining，×40）

3.4 IHE對Capan-2細胞凋亡的影響

4、8、16 μg/mL的IHE作用于細胞48 h后，細胞凋亡率均不同程度升高，且呈明顯的濃度依賴性。與0 μg/mL比較，8、16 μg/mL的IHE作用后細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）。0、4、8、16 μg/mL的IHE作用48 h后細胞的凋亡率依次為（8.43±2.47）%、（12.87±4.52）%、（23.97±3.24）%、（40.60±8.27）%（n＝3），流式圖見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度IHE作用48 h后細胞凋亡的流式圖Fig2 Flow cytometry charts of cell apoptosis after 48 h with different mass concentrations of IHE

3.5 IHE對細胞線粒體膜電位的影響

4、8、16 μg/mL的IHE作用于細胞24 h后，均可不同程度地降低細胞線粒體膜電位，且呈明顯的濃度依賴性。與0 μg/mL比較，16 μg/mL的IHE作用后線粒體膜電位下降細胞比例為（82.47±1.25）%（P＜0.01）。0、4、8、16 μg/mL的IHE作用24 h后線粒體膜電位下降的細胞比例依次為（3.8±0.61）%、（10.87±0.83）%、（19.2±1.01）%、（82.47±1.25）%，結(jié)果見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度IHE作用24 h后細胞線粒體膜電位的流式圖Fig3 Flow cytometry charts of mitochondria membrane potential after 24 h with different mass concentrations of IHE

3.6 IHE對細胞線粒體凋亡相關蛋白表達的影響

與0 μg/mL比較，8 μg/mL的IHE作用于細胞48 h后，細胞中Bcl-2、Mcl-1、PUMA、PARP蛋白表達明顯減弱（P＜0.05或P＜0.01）；16 μg/mL的IHE作用于細胞48 h后，細胞中PUMA、Mcl-1蛋白表達明顯減弱（P＜0.01）。蛋白表達電泳結(jié)果見圖4、測定結(jié)果見表2。

圖4 不同質(zhì)量濃度IHE作用48 h后細胞線粒體凋亡相關蛋白的電泳圖Fig4 Electrophoresis charts of mitochondrial apoptosis-related proteins after 48 h with different mass concentrations of IHE

4 討論

在本研究中，筆者采用了不同方法來驗證IHE對胰腺癌Capan-2細胞有增殖抑制作用，包括MTT試驗、克隆形成試驗和細胞核熒光染色試驗。在進行克隆形成試驗時，因作用時間較長，藥物濃度應低于IC50，故筆者采用了0、1、2 μg/mL的IHE進行試驗。在MTT預試驗中，筆者設置了0、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL的等濃度梯度，結(jié)果當IHE質(zhì)量濃度為8 μg/mL時細胞的增殖抑制作用已經(jīng)達到峰值，故正式試驗時IHE的質(zhì)量濃度設置為0、0.5、1、2、4、8 μg/mL。

表2 不同質(zhì)量濃度IHE作用48 h后細胞線粒體凋亡相關蛋白的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab2 Determination results of mitochondrial apoptosis-related proteins after 48 h with different mass concentrations of IHE（±s，n＝3）

表2 不同質(zhì)量濃度IHE作用48 h后細胞線粒體凋亡相關蛋白的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab2 Determination results of mitochondrial apoptosis-related proteins after 48 h with different mass concentrations of IHE（±s，n＝3）

注：與0 μg/mL比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.0 μg/mL，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

PARP/β-actin 0.77±0.01 0.66±0.01 0.31±0.02＊0.78±0.01 IHE質(zhì)量濃度，μg/mL 0481 6 Bax/β-actin 1.41±0.02 1.27±0.01 1.26±0.02 1.28±0.03 Bcl-2/β-actin 0.82±0.03 0.58±0.01 0.41±0.02＊0.98±0.03 Mcl-1/β-actin 1.48±0.08 0.51±0.02 0.17±0.01＊＊0.08±0.01＊＊PUMA/β-actin 1.01±0.03 0.63±0.01 0.23±0.01＊＊0.28±0.03＊＊

JC-1是一種陽離子染料，可以檢測細胞線粒體膜電位的變化。當細胞線粒體膜電位較高時，JC-1能聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；當線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集，以單體存在，此時產(chǎn)生綠色熒光[7]。當JC-1從紅色熒光到綠色熒光轉(zhuǎn)變時可以反映出線粒體膜電位的下降，而線粒體膜電位下降則是細胞早期凋亡的一個重要標志。線粒體膜電位下降后可以促使線粒體釋放細胞色素C[8]，細胞色素C與凋亡酶激活因子（Apaf-1）結(jié)合后能夠催化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）的活化，最終使下游Caspase-3活化而誘導細胞凋亡[9]。PARP作為細胞凋亡核心成員Caspase水解的切割底物，其在DNA損傷修復和細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。PARP在體內(nèi)是Caspase-3的主要切割對象，被剪切后PARP的羧基端的催化結(jié)構(gòu)域（89 kD）和氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（24 kD）分離，使其失去酶活力，其裂解片段的出現(xiàn)被認為是細胞凋亡的重要信號[7]。Bcl-2家族蛋白成員是線粒體凋亡通路的重要調(diào)節(jié)因子，如Bak、Bax等可以促進細胞凋亡，Bcl-2、Mcl-1等可以抑制細胞凋亡，另外還有一些BH3-only蛋白（如NOXA、PUMA等）也可促進細胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，Capan-2細胞經(jīng)IHE處理后，隨著IHE質(zhì)量濃度的增加細胞線粒體膜電位明顯下降，細胞凋亡率明顯升高。此外，從Western blot的結(jié)果也可以看到，抑凋亡蛋白Mcl-1的表達隨著IHE質(zhì)量濃度的增加而減弱；而Bcl-2的表達也隨著IHE質(zhì)量濃度的增加而減弱，但在高質(zhì)量濃度（16 μg/mL）IHE的作用下則有反饋性的上調(diào)；而促凋亡蛋白Bax則無明顯變化。BH3-only蛋白PUMA的表達也隨著IHE質(zhì)量濃度的增加而減弱。PARP在高質(zhì)量濃度IHE處理后出現(xiàn)裂解片段。本研究結(jié)果表明，IHE可能是通過引起線粒體膜電位的下降，從而引起胰腺癌Capan-2細胞的凋亡。

綜上所述，IHE對人胰腺癌Capan-2細胞具有較強的體外增殖抑制作用。其作用機制可能是通過引起線粒體膜電位的下降，下調(diào)細胞中Mcl-1、PUMA蛋白的表達，從而引起胰腺癌細胞的凋亡。

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Study on the Inhibitory Effect and Mechanism of Inula helenium Ethyl Acetate Extract on Proliferation of Human Pancreatic Cancer Capan-2 Cells

WANG Linling1，ZENG Jianmei1，YAN Youyou2，ZHANG Bo2，LIN Nengming1，2（1.Transformational Medicine Research Center，Hangzhou First Hospital Affiliated to Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310006，China；2.Transformational Medicine Research Center，Hangzhou First People’s Hospital/Hangzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Hangzhou，310006，China）

OBJECTIVE：To study the inhibitory effect and mechanism of Inula helenium ethyl acetate extract（IHE）on proliferation of human pancreatic cancer Capan-2 cells.METHODS：MTT was used to determine the cell proliferation inhibition rate after treated by 0，0.5，1，2，4，8 μg/mL IHE；clone formation test was used to observe the effects of 0，1，2 μg/mL IHE treating for 1 week on cell clone formation；Hoechest 33342 staining was used to observe the changes of nuclear morphology after treated by 0，2，4 μg/mL IHE for 48 h；flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate after treated by 0，4，8，16 μg/mL IHE for 48 h；JC-1 staining was used to observe the changes of intracellular mitochondrial membrane potential after treated by 0，4，8，16 μg/mL IHE for 24 h；Western blot was used to detect the expressions of mitochondrial apoptosis-related proteins Bcl-2，Bax，Mcl-1，p53 upregulated modulator of apoptosis（PUMA），and polymerase（PARP）after treated by 0，4，8，16 μg/mL IHE for 48 h.RESULTS：2，4，8 μg/mL IHE had obvious inhibitory effect on cell proliferation，showing concentration-dependent relationship，with IC50of 6.6 μg/mL；1，2 μg/mL IHE can obviously inhibit the clone formation of cells；4 μg/mL IHE can obviously cause cell nuclear condensation；8，16 μg/mL IHE can obviously promote the cell apoptosis，and the cell apoptosis rate reached 45.53%after treated by 16 μg/mL IHE for 48 h；16 μg/mL IHE treating for 24 h can cause the decrease of 82.47%cells’mitochondrial membrane potential；8 μg/mL IHE can obviously down-regulate the protein expressions of Bcl-2，Mcl-1，PUMA and PARP，and 16 μg/mL IHE can obviously down-regulate the expressions of Mcl-1 and PUMA.CONCLUSIONS：IHE may show its inhibitory effect on proliferation of human pancreatic cancer Capan-2 cells by causing the decrease of mitochondrial membrane potential in cells and down-regulating the protein expressions of Mcl-1 and PUMA to cause cell apoptosis.KEYWORDSInula helenium；Ethyl acetate extract；Human pancreatic cancer Capan-2 cells；Mitochondrion；Cell apoptosis

R285.5

A

1001-0408（2017）31-4384-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.17

浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目（No.2010-190-4）

＊碩士研究生。研究方向：腫瘤藥理學。電話：0571-56007664。E-mail：sweetyling@126.com

#通信作者：教授，主任藥師，博士生導師。研究方向：臨床藥理學、臨床毒理學。電話：0571-56007809。E-mail：lnm1013@163.com

2017-02-09

2017-08-10）

（編輯：林靜）