周靜靜，周天洋，張俊杰#（1.錦州醫(yī)科大學(xué)河南省人民醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，鄭州450000；.河南省眼科研究所，鄭州450000）

HPLC 法測定兔眼角膜中艾沙康唑的濃度Δ

周靜靜1，2＊，周天洋2，張俊杰2#（1.錦州醫(yī)科大學(xué)河南省人民醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，鄭州450000；2.河南省眼科研究所，鄭州450000）

目的：建立測定兔眼角膜中艾沙康唑濃度的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。色譜柱為Waters X-Bridge C18，流動(dòng)相為0.2%冰乙酸-乙腈（49∶51，V/V），流速為0.7 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為284 nm，進(jìn)樣量為10 μL。取日本大耳白兔15只，雙眼分別滴加0.2%艾沙康唑混懸液50 μL，于給藥后5、15、30、60、90 min分別處死3只兔并剖取其角膜樣品，處理后進(jìn)樣測定艾沙康唑濃度。結(jié)果：角膜樣品中的艾沙康唑在0.031 2～2.24 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＝0.999 9），方法回收率為91.7%～105.6%（RSD≤6.88%，n＝5），提取回收率為100.50%～106.10%（RSD≤2.16%，n＝3），日內(nèi)（n＝5）、日間（n＝3）精密度和穩(wěn)定性（n＝5）試驗(yàn)的RSD均小于10%。結(jié)論：本方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可快速、準(zhǔn)確地測定兔眼角膜中艾沙康唑的濃度。

高效液相色譜法；艾沙康唑；角膜；兔

艾沙康唑是一種新的三唑類抗真菌藥，主要通過抑制麥角甾醇的生物合成干擾真菌細(xì)胞膜的形成，從而發(fā)揮較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用[1]。近年的研究表明，艾沙康唑的抗菌譜廣，對臨床大多數(shù)致病真菌，包括曲霉菌屬、念珠菌屬、鐮孢菌屬、接合菌、隱球菌等均具有較高的敏感性[2-6]，主要用于深部侵襲性真菌感染的治療[7-9]，而對于眼部真菌感染的治療尚未見報(bào)道。鑒于艾沙康唑的廣譜抗真菌性及較高敏感性，其有望用于眼部真菌感染的治療。我國真菌性角膜炎的致病菌主要為曲霉菌屬和鐮孢菌屬[10-12]。體外藥敏試驗(yàn)表明，艾沙康唑?qū)εR床上常見曲霉菌屬表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，對曲霉菌屬耐藥菌株也具有較高活性[4]，在治療眼部真菌感染方面表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用前景。

艾沙康唑在角膜中的吸收和分布是治療真菌性角膜炎的關(guān)鍵，但角膜組織中艾沙康唑濃度的測定方法未見報(bào)道。血液中艾沙康唑濃度測定多采用超高效液相色譜法（UPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLCMS）、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS）[13-15]。在此基礎(chǔ)上，筆者對測定方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好的方法，用以檢測兔眼角膜中的艾沙康唑的濃度。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 HPLC系統(tǒng)，包括2695分離單元、2487檢測器、Empower2色譜工作站（美國Waters公司）；AE260電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Eppendorf高速離心機(jī)（德國Abbott公司）。

1.2 藥品與試劑

艾沙康唑原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：A1130A，純度：98%）；0.2%艾沙康唑混懸液（河南省眼科研究所藥劑室自制，主要含艾沙康唑和聚乙二醇400，批號：20160704）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

日本大耳白兔15只，健康無眼疾，♂，體質(zhì)量2.2～2.6 kg，購自河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2016-0001。動(dòng)物房溫度為（25±2）℃，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters X-Bridge C18（150 mm×3 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：0.2%冰乙酸-乙腈（49∶51，V/V）；流速：0.7 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：284 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 角膜樣品的處理

取角膜樣品，精密稱量后剪碎，邊長約1～2 mm，加入400 μL甲醇，密封，2～8℃浸泡24 h，12 000 r/min離心（離心半徑為5.7 cm）8 min，即得浸出液，取上清液，進(jìn)樣測定。

2.3 專屬性考察

取空白角膜、空白角膜+艾沙康唑（0.373 μg/mL）、給藥5 min后的角膜，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，艾沙康唑的保留時(shí)間約為3.3 min，空白角膜樣品對艾沙康唑的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig1 HPLC chromatograms

2.4 線性范圍考察

稱取低溫干燥的艾沙康唑原料藥0.008 6 g于50 mL量瓶中，加入甲醇溶解、定容，振搖均勻，得到質(zhì)量濃度為168 μg/mL的艾沙康唑貯備液。精密量取貯備液，用甲醇依次稀釋制備成質(zhì)量濃度為2.24、1.12、0.373、0.187、0.062 3、0.031 2 μg/mL的艾沙康唑系列標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取系列標(biāo)準(zhǔn)液100 μL，置于相應(yīng)的尖頭玻璃試管中，40℃下氮?dú)獯蹈?，分別加入100 μL按“2.2”項(xiàng)下方法處理的空白角膜浸出液，渦旋振蕩2 min，溶解，混勻，得到質(zhì)量濃度為2.24、1.12、0.373、0.187、0.062 3、0.031 2 μg/mL的工作液，進(jìn)樣測定。以艾沙康唑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝2.27×10－5x－0.014 6（r2＝0.999 9），表明其在0.031 2～2.24 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限為0.010 4 μg/mL（信噪比為3）。

2.5 準(zhǔn)確度與精密度考察

量取“2.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1.12、0.373、0.062 3 μg/mL的艾沙康唑標(biāo)準(zhǔn)液各100 μL，40℃下氮?dú)獯蹈?，分別加入100 μL的空白角膜浸出液，渦旋震蕩2 min，混合均勻，得到高、中、低質(zhì)量濃度（1.12、0.373、0.062 3 μg/mL）的質(zhì)控樣品，各5份。進(jìn)樣測定并計(jì)算方法回收率，考察日內(nèi)精密度；3 d內(nèi)連續(xù)測定3次，考察日間精密度；以方法回收率表示準(zhǔn)確度。結(jié)果，高、中、低質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的平均方法回收率分別為101.2%～104.7%、98.9%～105.6%、91.7%～101.0%（RSD≤6.88%，n＝5），日內(nèi)（n＝5）、日間（n＝3）精密度RSD均小于10%，表明試驗(yàn)準(zhǔn)確度和精密度較好。

2.6 提取回收率考察

量取“2.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1.12、0.373、0.062 3 μg/mL的艾沙康唑標(biāo)準(zhǔn)液各100 μL，加入剪碎的空白角膜約0.015 g，密封，2～8℃浸泡24 h，12 000 r/min離心（離心半徑為5.7 cm）8 min，取上清液，得提取回收率試驗(yàn)樣品（ES），每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份。另取相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各100 μL，加入相對應(yīng)角膜質(zhì)量的同體積生理鹽水，混勻，得到提取回收率的對照樣品（EC），每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份。取以上樣品進(jìn)樣測定，得到各樣品的峰面積（A），計(jì)算提取回收率（AES/AEC×100%）。結(jié)果，高、中、低質(zhì)量濃度的艾沙康唑在角膜中的提取回收率分別為（106.10±1.35）%、（103.80±1.67）%、（100.50±2.17）%，RSD分別為1.27%、1.61%、2.16%（n＝3），表明提取效果較好，能滿足試驗(yàn)的要求。

2.7 浸出效率的考察

取日本大耳白兔3只，雙眼分別滴加0.2%艾沙康唑混懸液50 μL，5 min后處死，剖取角膜組織，精密稱定質(zhì)量后剪碎，加400 μL甲醇浸泡。分別于24、48、96 h后以12 000 r/min離心（離心半徑為5.7 cm）8 min，取上清液100 μL進(jìn)樣測定6次，對比各時(shí)間點(diǎn)測定的樣品濃度，計(jì)算浸出效率（即各時(shí)間點(diǎn)測得的藥物濃度）。采用SPSS 17.0軟件分析，兩時(shí)點(diǎn)間樣品濃度差異性的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果，24 h測定的樣品濃度與48 h、96 h相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝6），表明生物樣品浸泡24 h與浸泡48、96 h相比，提取藥物的量沒有顯著變化，即經(jīng)過甲醇浸泡24 h，生物樣品中的艾沙康唑即可提取完全。

2.8 穩(wěn)定性考察

取高、中、低質(zhì)量濃度（1.12、0.373、0.062 3 μg/mL）的質(zhì)控樣品，考察－20℃放置1個(gè)月、2～8℃放置96 h和室溫下放置24 h后的穩(wěn)定性。結(jié)果，上述條件下各質(zhì)量濃度樣品的RSD均小于10%（n＝5），表明角膜浸出液中的樣品在考察期間均穩(wěn)定。

2.9 兔眼角膜中艾沙康唑濃度的測定

將15只日本大耳白兔隨機(jī)分為5個(gè)時(shí)間組，每組3只，雙眼各滴入0.2%艾沙康唑混懸液50 μL（相當(dāng)于藥物100 μg，給藥劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），輕輕閉合眼瞼約30 s。分別于給藥5、15、30、60、90 min后于耳緣靜脈iv 4%戊巴比妥鈉2 mL/kg處死動(dòng)物，以生理鹽水（10 mL/眼）沖洗眼表，用無菌干棉球蘸去水分。剖取角膜組織，以生理鹽水（5 mL/眼）沖洗，用濾紙吸去附著水分，置于EP管中。將提取的角膜樣品置于－20℃冰箱保存，備用。測定時(shí)，取角膜樣品按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定。記錄艾沙康唑色譜峰面積，計(jì)算角膜浸出液中的藥物濃度（c角膜浸出液）和角膜樣品中的藥物濃度（c角膜）[c角膜＝c角膜浸出液×（0.4+m角膜）/m角膜，m角膜為角膜質(zhì)量]，并繪制濃度-時(shí)間曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 0.2%%艾沙康唑混懸液滴眼后兔眼角膜中艾沙康唑的濃度-時(shí)間曲線Fig2 Concentration-time curve of isavuconazole in rabbit cornea after dropping 0.2%%isavuconazole suspension into eyes

由圖2可知，給藥60 min后角膜中的平均藥物濃度由給藥5 min后的1.964 μg/g下降至0.368 μg/g。

3 討論

艾沙康唑的抗真菌譜廣、抗真菌效力強(qiáng)，在治療深部真菌感染方面已有廣泛的應(yīng)用，同時(shí)也為治療常見的曲霉菌以及其他難治性真菌引起的角膜病提供了新的選擇。艾沙康唑在血液中的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道較少[13-15]，而在眼部真菌感染的治療及眼部藥動(dòng)學(xué)研究方面尚未見報(bào)道。筆者在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上探索出一種簡便可靠的方法來測量角膜中艾沙康唑的濃度，用以研究艾沙康唑眼局部給藥系統(tǒng)在角膜中的藥物濃度，為其在眼部的應(yīng)用提供重要的參考。本方法采用甲醇靜置浸泡法處理樣品，HPLC法檢測角膜浸出液中的藥物濃度。結(jié)果證明，只需用400 μL甲醇，密封、冷藏（2～8℃）、靜置浸泡24 h即可完全提取兔眼角膜中的艾沙康唑。甲醇量過少則會(huì)導(dǎo)致其無法完全浸沒角膜組織，過多則會(huì)導(dǎo)致角膜浸出液中藥物濃度過低。本方法流動(dòng)相采用0.2%冰乙酸-乙腈，在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其與甲醇系統(tǒng)相比靈敏度更高、檢測限更低。在凍存條件下，角膜生物樣品在1個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，在冷藏和室溫條件下，浸出液中的艾沙康唑在96 h和24 h內(nèi)穩(wěn)定，完全可滿足試驗(yàn)測定的需求。值得注意的是，甲醇浸出液也無需進(jìn)行再次處理，離心后上清液可直接進(jìn)樣分析，干擾少、提取效率高、重現(xiàn)性好。本方法檢測提取液中艾沙康唑的檢測限在0.01 μg/mL左右，相當(dāng)于角膜中的藥物濃度0.2～0.3 μg/g，而艾沙康唑?qū)η咕鷮俚淖钚∫志鷿舛龋∕ICs）大部分在0.5 μg/mL以上[16]，因此本方法的靈敏度完全可滿足生物樣品的測定需求。

綜上所述，本研究建立的檢測兔眼角膜中艾沙康唑濃度的HPLC法專屬性強(qiáng)、靈敏度和重現(xiàn)性好，能夠方便準(zhǔn)確地測定兔眼角膜中艾沙康唑的濃度，可進(jìn)一步用于艾沙康唑的眼部藥動(dòng)學(xué)研究。

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Concentration Determination of Isavuconazole in Rabbit Cornea by HPLC

ZHOU Jingjing1，2，ZHOU Tianyang2，ZHANG Junjie2（1.Postgraduate Culture Base of Henan Province People’s Hospital，Jinzhou Medical University，Zhengzhou 450000，China；2.Henan Eye Institute，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of isavuconazole in rabbit cornea.METHODS：HPLC was performed on column of Waters X-Bridge C18with mobile phase of 0.2%glacial acetic acid-acetonitrile（49∶51，V/V）at flow rate of 0.7 mL/min，column temperature was 40℃，detection wavelength was 284 nm，and injection volume was 10 μL.Fifteen Japanese white rabbits with big ears were selected，50 μL of 0.2%isavuconazole suspension was dropped into eyes，then every 3 rabbits were executed after 5，15，30，60，90 min of administration and cornea samples were taken respectively.The determination of isavuconazole were determined after treating.RESULTS：The isavuconazole in leaching solution showed good linear range in 0.031 2-2.24 μg/mL（r2＝0.999 9）；oethod recovery rate was 91.7%-105.6%（RSD≤6.88%，n＝5）；extraction recovery rate was 100.50%-106.10%（RSD≤2.16%，n＝3）；and RSDs of inter-day（n＝3）and intra-day（n＝3）precision and stability（n＝5）tests were lower than 10%.CONCLUSIONS：The method shows strong specificity，high accuracy，good reproducibility，and can rapidly and accurately determine the concentration of isavuconazole in rabbit cornea.

HPLC；Isavuconazole；Cornea；Rabbits

R927.2

A

1001-0408（2017）31-4362-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.U1404832）

＊碩士研究生。研究方向：真菌性角膜炎。電話：0371-65580919。E-mail：1515204280@qq.com

#通信作者：研究員，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：眼科藥理及眼部給藥系統(tǒng)。電話：0371-65580919。E-mail：Zhangjj66@126.com

2017-03-16

2017-09-11）

（編輯：劉明偉）