陳麗艷，劉青，孫銀玲，王萍，張蕾，王偉明（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱150036）

不同產(chǎn)地淡豆豉優(yōu)勢發(fā)酵菌群的篩選及酶活性分析Δ

陳麗艷＊，劉青，孫銀玲，王萍，張蕾，王偉明#（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱150036）

目的：為淡豆豉生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。方法：分別采集黑龍江、河北、甘肅、山東、安徽、云南等6個產(chǎn)地的淡豆豉，以青蒿、桑葉選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵菌，分別采用福林酚法、纖維蛋白平板法、對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷顯色法測定菌株的蛋白酶、纖溶酶、β-葡萄糖苷酶活性以篩選發(fā)酵優(yōu)勢菌。結(jié)果：從6個產(chǎn)地淡豆豉中共分離出14個野生型菌株，包括3株細(xì)菌和11株霉菌。其中，從黑龍江產(chǎn)淡豆豉中分離出桿狀細(xì)菌1株和毛霉菌1株；從河北產(chǎn)淡豆豉中分離出毛霉菌2株和桿狀細(xì)菌1株；從甘肅產(chǎn)淡豆豉中分離出毛霉菌1株、青霉菌1株、微球菌1株、曲霉菌1株；從山東產(chǎn)淡豆豉中分離出毛霉菌2株；從安徽產(chǎn)淡豆豉中分離出毛霉菌1株和曲霉菌1株；從云南產(chǎn)淡豆豉中僅分離出毛霉菌1株。根據(jù)菌種類別及酶活性測定結(jié)果分析，初步判定其中的1號桿狀細(xì)菌、9號曲霉菌、11號和14號毛霉菌為優(yōu)勢發(fā)酵菌，4種菌的3種酶總活性分別為22.77、25.49、41.32、39.13 U/g。結(jié)論：不同產(chǎn)地淡豆豉中發(fā)酵菌有所不同，通過酶活性分析可初步篩選出優(yōu)勢發(fā)酵菌。

淡豆豉；產(chǎn)地；選擇性培養(yǎng)基；優(yōu)勢菌；酶活性

淡豆豉飲片為豆科植物大豆[Glycine max（L.）Merr.]的成熟種子的發(fā)酵加工品，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱等功效[1-2]，從1963年版《中國藥典》（一部）開始一直到2015年版均有記載。從古至今，淡豆豉的生產(chǎn)一直采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝，參與發(fā)酵的菌種不明確，且菌種隨環(huán)境的變化而不同，因此造成不同產(chǎn)地、不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，阻礙了淡豆豉生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，進(jìn)而直接影響了其臨床用藥的安全性和有效性。淡豆豉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵在于發(fā)酵菌種標(biāo)準(zhǔn)化，因此篩選優(yōu)勢發(fā)酵菌種極為重要。

豆豉、淡豆豉發(fā)酵菌群的培養(yǎng)通常采用常規(guī)培養(yǎng)基[3-4]，培養(yǎng)出的微生物種類較多。淡豆豉為青蒿、桑葉的煎煮液浸泡大豆后經(jīng)自然發(fā)酵而得，而常規(guī)培養(yǎng)基與淡豆豉基質(zhì)成分存在明顯差異，對于淡豆豉的菌種分離不具更好的適應(yīng)性和選擇性，使菌種的篩選過程煩瑣、耗時長。作者前期研究已建立了用含有青蒿、桑葉煎煮液的選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)淡豆豉發(fā)酵優(yōu)勢菌的方法[5]，此方法可快速、準(zhǔn)確地篩選淡豆豉優(yōu)勢菌。另外，發(fā)酵過程中微生物會產(chǎn)生豐富的酶：蛋白酶可將大豆蛋白水解成小分子肽類和游離氨基酸[6]；β-葡萄糖苷酶能催化水解烴基與糖基的糖苷鍵，將大豆中的苷類降解為苷元，更利于人體吸收[7]；纖溶酶是豆豉發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的具有溶栓作用的活性物質(zhì)[8]。這3種酶的活性高低均會影響淡豆豉的功效。

本研究通過青蒿、桑葉選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)不同產(chǎn)地淡豆豉飲片的發(fā)酵菌群，并通過蛋白酶、β-葡萄糖苷酶及纖溶酶的活性測定初步篩選發(fā)酵優(yōu)勢菌，為淡豆豉生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DL-CJ-2N凈化工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；BSA224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；MF3多功能一體機(jī)（杭州迅數(shù)科技有限公司）；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；WH-2微型渦旋混合儀（北京京立離心機(jī)有限公司）；Legend Micro 17R冷凍高速離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；M2000多功能酶標(biāo)儀[帝肯（上海）貿(mào)易有限公司]；400C離心機(jī)（北京白洋離心機(jī)有限公司）。

1.2 藥材

桑葉、青蒿購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定分別為桑科植物桑（Morus alba L.）的葉和菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分。根據(jù)我國淡豆豉生產(chǎn)企業(yè)所處的地理位置及生產(chǎn)環(huán)境共采集6個具有代表性的產(chǎn)地的淡豆豉飲片進(jìn)行分析，詳細(xì)信息見表1。

表1 6個產(chǎn)地淡豆豉飲片信息Tab1 Information of Sojae semen praeparatum from 6 production places

1.3 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA，批號：20150916）、瓊脂粉（批號：20150606）均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（批號：140604-201224）、纖維蛋白原（批號：140626-201611）、凝血酶原（批號：20130306）均購于中國食品藥品檢定研究院；對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（PNPG）、酪氨酸、對硝基苯酚均為分析純。

2 方法

2.1 樣品的處理及發(fā)酵菌培養(yǎng)

參照作者前期研究方法[5]制備選擇性培養(yǎng)基及菌液樣品。采用平板稀釋法將不同濃度菌液接種至鋪有選擇性培養(yǎng)基的平皿上，于（28±2）℃恒溫培養(yǎng)2～6 d，觀察并記錄菌落生長情況。

2.2 菌種的初步鑒定

將分離菌種純化后用試管馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)并于4℃保存。通過菌落形態(tài)及顯微特征并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[9]和《真菌鑒定手冊》[10]對菌種進(jìn)行初步鑒定。然后對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，對霉菌采用扦片法培養(yǎng)后進(jìn)行顯微觀察。

2.3 酶活性測定

經(jīng)“2.1”“2.2”項(xiàng)下方法得到的菌株進(jìn)行酶活性測定，以篩選優(yōu)勢發(fā)酵菌群。分別采用福林酚法測定蛋白酶活性[11]，PNPG顯色法測定β-葡萄糖苷酶活性[12]，纖維蛋白平板法測定纖溶酶活性[13]。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地淡豆豉發(fā)酵菌群分離結(jié)果

不同產(chǎn)地淡豆豉發(fā)酵菌的種類及數(shù)量見表2。

表2 不同產(chǎn)地淡豆豉發(fā)酵菌的種類及數(shù)量Tab2 Species and quantities of fermentive bacteria in Sojae semen praeparatum decoction pieces from different production places

由表2可見，從6個產(chǎn)地淡豆豉中共分離出14株野生型菌株，經(jīng)初步鑒定，其中細(xì)菌3株（桿狀細(xì)菌2株、微球菌1株）、霉菌11株（其中毛霉菌8株、曲霉菌2株、青霉菌1株）。可見，不同產(chǎn)地淡豆豉中發(fā)酵菌有所不同，其中從CD1淡豆豉中篩選出桿狀細(xì)菌1株和毛霉菌1株；從CD2淡豆豉中篩選出毛霉菌2株和桿狀細(xì)菌1株；從CD3淡豆豉中篩選出毛霉菌1株、青霉菌1株、微球菌1株、曲霉菌1株；從CD4淡豆豉中篩選出毛霉菌2株；從CD5淡豆豉中篩選出毛霉菌1株和曲霉菌1株；從CD6淡豆豉中僅分離出毛霉菌1株。

3.2 酶活性測定結(jié)果

不同產(chǎn)地淡豆豉發(fā)酵菌的酶活性見圖1。

由圖1可見，其中1、11、14號菌的纖溶酶活性較高，2、7、10號菌的β-葡萄糖苷酶活性較高，9、11、14號菌的蛋白酶活性較高，而4、10、13號菌的蛋白酶活性處于較低水平。1、9、11、14號菌的酶活性綜合水平較高，3種酶總活性分別為22.77、25.49、41.32、39.13 U/g，初步確定為優(yōu)勢發(fā)酵菌群。

圖1 不同產(chǎn)地淡豆豉發(fā)酵菌的酶活性比較Fig1 Comparison of enzyme activities of fermentive bacteria in Sojae semen praeparatum from different production places

3.3 優(yōu)勢發(fā)酵菌的顯微形態(tài)觀察結(jié)果

淡豆豉優(yōu)勢發(fā)酵菌群的顯微特征觀察結(jié)果見圖2。

圖2 淡豆豉優(yōu)勢發(fā)酵菌的顯微特征Fig2 Microscopic features of dominant fermentive bacteria in Sojae semen praeparatum

結(jié)合菌落形態(tài)并根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[9]和《真菌鑒定手冊》[10]，可初步判定1號菌為桿狀細(xì)菌，9號菌為曲霉菌，11、14號菌均為毛霉菌，但顯微形態(tài)仍有差異，可能為同屬不同種，但分離的菌株仍需進(jìn)一步鑒定。

4 討論

淡豆豉為自然條件下多菌種混合發(fā)酵而成，因地區(qū)、季節(jié)及生產(chǎn)環(huán)境不同菌群會發(fā)生變化，而淡豆豉質(zhì)量、風(fēng)味、功效也會隨菌群變化而存在差異。本研究對6個不同產(chǎn)地淡豆豉樣品進(jìn)行菌群種類、數(shù)量及酶活性分析，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地淡豆豉的微生物群系及主要發(fā)酵菌存在明顯不同，通過酶活性分析可初步確認(rèn)優(yōu)勢發(fā)酵菌。

與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的不同產(chǎn)地淡豆豉發(fā)酵菌的研究比較，本研究應(yīng)用青蒿、桑葉選擇性培養(yǎng)基是以2015年版《中國藥典》（一部）中淡豆豉飲片的炮制工藝為基礎(chǔ)，模擬淡豆豉發(fā)酵環(huán)境并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該培養(yǎng)基可選擇性抑制有害菌、保留發(fā)酵優(yōu)勢菌，分離篩選出的菌種種類較少，使菌種篩選更加簡便、快捷。鑒于飲片在干燥、存貯、運(yùn)輸及銷售過程中難免發(fā)生二次污染，因此在制備菌液時，需用無菌生理鹽水多次洗滌淡豆豉飲片以盡可能減少外界雜菌干擾，使發(fā)酵優(yōu)勢菌更具代表性。淡豆豉為自然條件下多菌種混合發(fā)酵而成，通過酶活性分析篩選出發(fā)酵優(yōu)勢菌?？筛鶕?jù)不同菌的酶學(xué)特性重新組合發(fā)酵菌種，再進(jìn)一步考察其發(fā)酵工藝及異黃酮類等功效成分變化，為淡豆豉發(fā)酵菌種標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

綜上所述，本研究所獲得的優(yōu)勢菌均為自然界野生型菌株，通常作為始發(fā)菌，再經(jīng)人工選育，即以功效產(chǎn)物為靶標(biāo)，采用定向誘變等遺傳育種技術(shù)才能獲得更高活性的生產(chǎn)用菌株。此外，還需進(jìn)行傳統(tǒng)發(fā)酵工藝向現(xiàn)代發(fā)酵工藝的轉(zhuǎn)變，為優(yōu)良菌種提供最佳發(fā)酵環(huán)境條件，從而獲得功效穩(wěn)定、安全可控的淡豆豉產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)真正意義上的淡豆豉生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：328.

[2] 李剛，梁永紅，楊安金，等.淡豆豉不同制法其成品性狀及異黃酮類化學(xué)成分含量的比較[J].中國藥房，2014，25（47）：4461-4463.

[3] 管泳宇，吳滿剛，葛慶豐，等.曲霉型豆豉優(yōu)勢菌株篩選與鑒定[J].食品工業(yè)科技，2012，33（23）：178-182.

[4] 李剛，龍凱，蘇明聲，等.淡豆豉炮制至“黃衣上遍”過程中微生物菌群動態(tài)變化的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（11）：139-142.

[5] 陳麗艷，劉青，張蕾，等.分離篩選淡豆豉發(fā)酵菌的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18（7）：822-825.

[6] 房翠蘭.豆豉加工過程中蛋白質(zhì)和膳食纖維生物學(xué)變化的研究[D].重慶：西南大學(xué)，2007.

[7] 孫艷梅，張永忠.水解制備大豆異黃酮苷元研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2002，23（3）：11-13.

[8] 朱春節(jié)，湯祝華，謝秀禎.豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（12）：1779-1785.

[9] 布坎南RE，吉本斯NE.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學(xué)出版社，1984：16-1207.

[10] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：1-649.

[11] 國家國內(nèi)貿(mào)易局.中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317-1999蛋白酶活力測定法[S].1999-04-15.

[12] 鄭芳，曹小芳，張亞玲，等.一株β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（8）：1059-1068.

[13] 劉向輝，戈峰.蚯蚓纖溶酶活性影響因子的研究[J].中國中藥雜志，2002，27（6）：423-426.

[14] 湯揚(yáng)，熊敏剛.貴州中成藥用淡豆豉發(fā)酵菌種的分離鑒定及純種發(fā)酵[J].貴州醫(yī)藥，1999，23（4）：318-319.

Screening and Enzymatic Activity Analysis of Dominant Fermentive Bacteria of Sojae Semen Praeparatum from Different Production Places

CHEN Liyan，LIU Qing，SUN Yinling，WANG Ping，ZHANG Lei，WANG Weiming（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China）

OBJECTIVE：To provide reference for the standardized production of Sojae semen praeparatum（SSP）.METHODS：SSP samples from Heilongjiang，Hebei，Gansu，Shandong，Anhui and Yunnan were respectively collected.The fermentive bacteria were cultured with the selective medium contained artemisiae annuae herba and mori folium.Foline-phenol method，fibrous protein plate method and p-nitrophenol-β-D-glucoside colorimetric method were respectively conducted to determine the activities of protease，plasmin and β-glucosidase of the strains to screen dominant fermentive bacteria.RESULTS：Totally 14 wild strains were separated from SSP samples from 6 production places，including 3 strains of bacteria and 11 strains of molds.1 strain of rod-shaped bacteria and 1 strain of Mucor sp.were separated from SSP from Heilongjiang；2 strains of Mucor sp.and 1 strain of rod-shaped bacteria were separated from SSP from Hebei；1 strain of Mucor sp.，1 strain of Penicillium sp.，1 strain of Streptococcus sp.and 1 strain of Aspergillus sp.were separated from SSP from Gansu；2 strains of Mucor sp.were separated from SSP from Shandong；1 strain of Mucor sp.and 1 strain of Aspergillus sp.were separated from SSP from Anhui；and only 1 strain of Mucor sp.was separated from SSP from Yunnan.According to the strains category and enzyme activities，No.1 bacillus，No.9 Aspergillus sp.，No.11 and No.14 Mucor sp.were preliminary authenticated as dominant fermentation microorganism，total enzyme activities of the 4 strains were 22.77，25.49，41.32，39.13 U/g respectively.CONCLUSIONS：The fermentive bacteria of SSP from different production places were different，and the dominant one can be screened preliminary through enzyme activity analysis.

Sojae semen praeparatum；Production place；Selective medium；Dominant bacteria；Enzyme activity

R932

A

1001-0408（2017）31-4359-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.10

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（No.201507004-03）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃新創(chuàng)辦企業(yè)項(xiàng)目（No.PB15F005）

＊主任藥師，碩士。研究方向：發(fā)酵類中藥的研究。電話：0451-55653086-6845。E-mail：cly9998@163.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥新藥開發(fā)及中藥資源研究。電話：0451-55665478。E-mail：1442540238@qq.com

2017-02-15

2017-05-10）

（編輯：余慶華）