周敏+高慧新+王孝勛+蔣嫦月+封毅+田慧

摘要：為建立雞血藤ISSR-PCR的優(yōu)化反應(yīng)體系，通過(guò)選用DNA模板量、Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物濃度等5個(gè)因素中各單因素的適宜濃度，利用正交試驗(yàn)方法，在5個(gè)因素4個(gè)水平條件下進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞血藤ISSR-PCR的最佳25 μL PCR反應(yīng)體系中含10×PCR buffer 2.50 μL、DNA模板量70.00 ng、Mg2+ 1.50 mol/L、Taq DNA聚合酶1.50 U、dNTP 0.30 mmol/L，引物濃度0.35 μmol/L。為雞血藤種質(zhì)資源遺傳多樣性的進(jìn)一步研究奠定分子基礎(chǔ)，也為同科屬植物的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究提供參考。

關(guān)鍵詞：雞血藤；ISSR 反應(yīng)體系；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S567.901文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0054-03

作者簡(jiǎn)介：周敏（1991—），女，江西贛州人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幤贩N鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：zmlww1020@163.com。

通信作者：田慧，碩士，教授，研究方向?yàn)橹兴幤贩N鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：377244732@qq.com?！吨袊?guó)藥典》2015版規(guī)定雞血藤來(lái)源于豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖[1]。雞血藤為我國(guó)常用中藥，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等。雞血藤主要分布于廣西壯族自治區(qū)、廣東省、云南省、越南等地，由于近年來(lái)雞血藤生境遭受了嚴(yán)重破壞及用藥需求不斷增長(zhǎng)，其野生資源日益減少，價(jià)格也不斷攀升。雞血藤的引種栽培受到了高度重視，目前在廣西壯族自治區(qū)、廣東省等地已建成一些雞血藤野生撫育或規(guī)范化生產(chǎn)示范基地，但不同產(chǎn)地及人工栽培造成藥材質(zhì)量良莠不齊，因此選擇栽培地雞血藤顯得十分必要。雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)雞血藤的性狀、顯微、理化等方面進(jìn)行了較多的研究，在雞血藤種質(zhì)資源方面也有少數(shù)學(xué)者進(jìn)行了分子方面的研究[2-4]。如翟明等從110條RAPD引物中篩選出9條RAPD隨機(jī)引物，對(duì)不同產(chǎn)地的雞血藤進(jìn)行了研究[5]；安冉等利用26S DNA D1-D3區(qū)序列差異鑒別雞血藤及其混偽品[6]；筆者所在課題組田輝等采用RAPD與ISSR標(biāo)記的方法初步對(duì)廣西省產(chǎn)雞血藤進(jìn)行了遺傳多樣性的比較分析研究[7]。但目前尚未見(jiàn)有建立穩(wěn)定的ISSR反應(yīng)體系的報(bào)道，故本試驗(yàn)對(duì)雞血藤ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行建立與優(yōu)化，運(yùn)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)建立一套準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)且適用于大批量雞血藤種質(zhì)材料微衛(wèi)星標(biāo)記的ISSR-PCR反應(yīng)體系，不僅為雞血藤種質(zhì)資源遺傳多樣的進(jìn)一步研究奠定了分子基礎(chǔ)，也為同科屬植物的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究提供了參考。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗(yàn)材料為雞血藤嫩葉，采自廣西藥用植物園栽培基地，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)田慧教授鑒定為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1試劑DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、5×TBE購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂糖（西班牙），GelRed核酸凝膠染料（美國(guó)），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2儀器Eppendorf移液槍（德國(guó)）、SIGMA Sartorius臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)）、T-Gradient型梯度PCR儀（德國(guó)）、Bio-rad電泳儀（美國(guó)）、ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)）、MILIPORE超純水機(jī)（法國(guó)）、渦旋振蕩儀器（上海青浦滬西儀器廠）、微量分光光度計(jì)（日本島津）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1雞血藤DNA的提取根據(jù)天根生化科技（北京）有限公司植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)材料總DNA的提取，同時(shí)采用微量分光光度法定量檢測(cè)其質(zhì)量及濃度，并稀釋至10 ng/μL以供后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2單因素試驗(yàn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，本試驗(yàn)ISSR基本反應(yīng)體系的組成為總體積25 μL，其中DNA模板30.00 ng、Mg2+ 1.50 mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1.50 U，引物濃度0.30 μmol/L，10×反應(yīng)buffer 2.5 μL，其余用滅菌超純水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸5 min。待反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物置于4 ℃冰箱中保存。根據(jù)筆者所在課題組前期試驗(yàn)結(jié)果，選用43號(hào)引物（引物序列為5′-3′GATGATGATGATTC）。反應(yīng)選用DNA模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物為考察因素，反應(yīng)體系中單因素梯度設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，即在單一因素變化的條件下，保持其他因素不變，從而篩選出比較適宜的濃度范圍。取擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，點(diǎn)樣于1.0%瓊脂糖凝膠的上樣孔中，以1 500 bp DNA ladder marker為對(duì)照分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在0.5×TBE緩沖液中電壓 75 V 電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照、記錄、分析檢測(cè)結(jié)果。

宜范圍為參考依據(jù)，選用L16（45）正交表，在4個(gè)水平上進(jìn)行試驗(yàn)（表2）。

2結(jié)果與分析

2.1DNA模板添加量對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，添加DNA模板20 ng時(shí)，擴(kuò)增出來(lái)的條帶暗且少，說(shuō)明添加量低對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增影響較大。隨著添加量的增加，擴(kuò)增條帶增多，因此正交試驗(yàn)中選用的模板添加量為40、50、60、70 ng。

2.2Mg2+濃度

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)Mg2+濃度為0.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶最少，且不清晰，當(dāng)濃度為1.0 mmol/L時(shí)，條帶逐漸增多，當(dāng)濃度為3.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶減少。由于Mg2+是Taq DNA聚合酶的輔助因子，其濃度影響Taq DNA聚合酶的活性，又兼在保證特異性條帶和清晰度的情況下，故確定

ISSR體系中Mg2+適宜濃度為1.0～2.0 mmol/L。

2.3dNTP濃度

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)dNTP濃度為0.05～0.10 mmol/L時(shí)，PCR的產(chǎn)率較低，擴(kuò)增出來(lái)的條帶模糊。隨著濃度的升高，非特異性條帶增多，堿基的錯(cuò)配率增加。故正交試驗(yàn)中dNTP適宜濃度為0.15～0.30 mmol/L。

2.4Taq DNA聚合酶添加量

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，隨著Taq DNA聚合酶添加量的增加，特異性條帶增加，亮度也增加。Taq DNA聚合酶是PCR反應(yīng)中重要的影響因素，量太少不能擴(kuò)增出特性條帶，Taq DNA聚合酶價(jià)格高，量太多增加成本。故正交試驗(yàn)中選用Taq DNA聚合酶添加量為1～2 U。

2.5引物濃度

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，引物濃度對(duì)PCR產(chǎn)生的影響很大，濃度過(guò)低時(shí)PCR產(chǎn)物會(huì)大大降低，影響正常的擴(kuò)增；濃度過(guò)大時(shí)，PCR擴(kuò)增的條帶變得模糊，非特異性增加。故正交試驗(yàn)中選用引物濃度為0.2～0.4 μmol/L。

2.6正交試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，條帶穩(wěn)定、清晰、豐富的最佳產(chǎn)物記為16分，最差的記1分。編號(hào)1～16打分結(jié)果依次為1、2、4、6、5、3、7、8、16、14、15、13、10、12、11、9。根據(jù)打分結(jié)果算出每個(gè)因素同水平下的均值和極差（表3）。極差值反映出影響因子對(duì)反應(yīng)體系的影響，而且極差值越大，影響越明顯。由表3可知，各因素對(duì)雞血藤ISSR-PCR反應(yīng)影響大小的先后次序?yàn)門aqDNA聚合酶添加量>Mg2+濃度>引物濃度>DNA模板添加量>dNTP濃度。每個(gè)因素同水平下的均值反映出影響因子各水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，均值越大，反應(yīng)水平越好[10]。因此，雞血藤最優(yōu)反應(yīng)體系為TaqDNA聚合酶 1.50 U，DNA模板為 70 ng，Mg2+為1.5 mmol/L，dNTP為030 mmol/L，引物 0.35 μmol/L。

4結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在親緣關(guān)系、品種鑒定及遺傳多樣性檢測(cè)等方面得到了廣泛應(yīng)用[11-13]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)容易受外界環(huán)境因素的影響，如PCR體系的配置、引物、退火溫度等。目前常用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)ISSR試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，單因素試驗(yàn)可選定單個(gè)因素最佳試驗(yàn)條件的范圍，如張福生等運(yùn)用單因素試驗(yàn)建立與優(yōu)化了金線蓮的ISSR反應(yīng)體系[14]。正交試驗(yàn)可平衡分析各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的綜合影響，可更加準(zhǔn)確地得到最佳優(yōu)化條件，如曹嵩曉利用單因子和正交設(shè)計(jì)雙重試驗(yàn)方法優(yōu)化了廣藿香ISSR-PCR試驗(yàn)體系，從而得到最佳反應(yīng)體系[15]。本研究綜合運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)2種方法，克服單一試驗(yàn)方法的局限性。

本研究結(jié)果表明，ISSR反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶添加量對(duì)結(jié)果的影響極大，Taq DNA聚合酶在水中不易溶解完全，稀釋時(shí)須溶解在2×反應(yīng)buffer中。篩選合適的引物，有利于結(jié)果的判斷，合適的退火溫度可使目的條帶最大程度地?cái)U(kuò)增，也可使目的條帶更亮。因此，本試驗(yàn)選出雞血藤的最佳反應(yīng)體系為TaqDNA聚合酶1.50 U，DNA模板70 ng，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.30 mmol/L，引物0.35 μmol/L，最佳退火溫度36 ℃。本試驗(yàn)確定了雞血藤的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系，也為同科屬植物的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究提供了參考，為后續(xù)雞血藤種質(zhì)多態(tài)性研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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