盧秀嫻 張思遠(yuǎn) 葉賀佳 梅廷媛/廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司

雞傳染性支氣管炎病毒廣東分離株S1基因的克隆與序列分析

盧秀嫻 張思遠(yuǎn) 葉賀佳 梅廷媛/廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司

雞傳染性支氣管炎 （infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒 （infectious bronchitis virus）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要影響呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等。各種日齡的雞都會(huì)感染IBV，主要引起呼吸困難、腎炎、產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)的下降，IBV 還可侵害腎臟、腸道、腺胃、肌肉等組織，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)上的損失。IBV自身有結(jié)構(gòu)特殊性，并且RNA聚合酶具有不完善的糾錯(cuò)機(jī)制能力，使得病毒基因組在復(fù)制的過(guò)程易突變和重組頻率增高，能夠產(chǎn)生許多血清型，目前已報(bào)道的血清型已有30多種，在我國(guó)主要以Mass，T，Gray 和 Holte 株等為主。

IBV基因組為線性單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約27.6 kb，編碼小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和纖突蛋白（S）4 種主要結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)S蛋白與宿主細(xì)胞膜上的病毒受體結(jié)合，并通過(guò)宿主細(xì)胞的蛋白酶裂解到S1和S2時(shí)，病毒包膜可與細(xì)胞膜結(jié)合，病毒纖突能表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性，S1基因是誘導(dǎo)和選擇性接受中和抗體的特異位點(diǎn)。S1可刺激中和和血凝抑制抗體，只有S1蛋白能誘導(dǎo)中和抗體，使機(jī)體起到有效地保護(hù)。雖然IBV的遺傳變異可以在基因組中的任何部分發(fā)生，但主要集中在病毒的S1基因。

S1蛋白是主要的感染性和致病性的病毒蛋白，其結(jié)構(gòu)差異性導(dǎo)致了血清型的差異及變異株的存在，并且與IBV抗原性漂變和致病性的改變有關(guān)，并且還可以決定IBV血清型特異性抗原決定簇。S1蛋白的氨基酸序列之間的差異性有可能改變毒株之間的血清型，導(dǎo)致新的變異株出現(xiàn)，使其抗原性或免疫原性的改變。

本研究于2017年5月份在廣東省某疑似患雞傳染性支氣管炎的雞場(chǎng)病料被分離到1株IBV，并對(duì)IBV分離株 S1基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列基因遺傳變異分析。

一、材料與方法

1.病料來(lái)源、SPF雞胚及主要的試劑

病料樣品為2017年5月廣東某雞場(chǎng)疑似感染IBV雞的氣管、心臟、肝臟、腎臟等樣品；10日齡SPF雞胚購(gòu)自梅里亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；11日齡SPF雞胚購(gòu)自梅里亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； RNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自北京全式金公司；2XPhanta PCR Master Mix購(gòu)自諾唯贊生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和核酸染料均購(gòu)自TIANGEN公司，pMD20-T載體購(gòu)自TaKaRa公司

2.引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank中公布的IBV S1基因組序列，利用 Primer premier 6.0軟件及oligo6.0，針對(duì)IBV基因組S1基因的保守基因區(qū)間設(shè)計(jì)1對(duì)特異性檢測(cè)引物 IBS1(上 游 )：5'-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3'(下 游 )：5'-AACCTTGGCCTACTCTGC-3'；根據(jù) S1基因兩端外的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增S1全長(zhǎng)基因的引物，引物的理論跨幅為1722bp，可將S1 基因片段完全覆蓋，引物序列：S1P1(上游)：5'-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3'，S1P2(下游 )：5'-CCATAACTAACATAAGGGCA-3'。由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成引物。

3.病毒分離

采集臨床病料（主要是氣管肝臟、腎臟等組織），研碎后加入適量PBS，在-20℃和常溫條件下反復(fù)凍融3次，8000 r/min離心10 min，取上清液，加入雙抗（含200 U/ml 青霉素和200μg/ml鏈霉素）混合，作用2 h后，取0.2 ml接種于11日齡SPF雞胚的尿囊腔，放于37℃培養(yǎng)箱中孵育。36～48 h后收取雞胚的尿囊液，連續(xù)在SPF雞胚上盲傳3代。

4.IBV分離株RT-PCR鑒定和S1全長(zhǎng)基因擴(kuò)增

提取病毒的尿囊液中的RNA基因組，按照天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以合成的cDNA為模板，采用S1基因特異性檢測(cè)引物與S1基因全長(zhǎng)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 S，54℃退火30S，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物以110V，50 mA電流進(jìn)行電泳，結(jié)果約25 min后在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察。

5.IBV分離株S1基因的克隆測(cè)序

按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，回收PCR擴(kuò)增的IBV S1全長(zhǎng)基因片段，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD20-T克隆載體4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂平板藍(lán)白斑篩選，挑去白色單菌落接種到 LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)震蕩培養(yǎng)12 h后，菌液經(jīng)PCR鑒定后，呈陽(yáng)性的被選送至英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序部進(jìn)行基因全長(zhǎng)序列的測(cè)定及拼接。

6.IBV分離株S1基因的序列分析

MEGA6.0分析軟件進(jìn)行比較測(cè)定的S1基因序列，與參考株繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。其中序列比對(duì)使用Clustal W多重比對(duì)方法，在進(jìn)化樹(shù)繪制中選用Neighbor-Joining算法。

二、結(jié)果與分析

1.病毒的分離與鑒定

將病料進(jìn)行處理與分離培養(yǎng)，利用針對(duì)IBV的S1基因特異性檢測(cè)引物和S1全長(zhǎng)基因的引物，通過(guò)RTPCR對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果能擴(kuò)增出大小約為500 bp、1 722 bp的兩條預(yù)期目的片段，而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶（圖1和圖2），表明該毒株為IBV，命名為CKGD/180/2017 。

2.S1基因序列分析

CK/GD/180/2017 S1基因全長(zhǎng)1 620 bp(從起始密碼子ATG到S前體蛋白裂解位點(diǎn))，編碼540個(gè)氨基酸，其裂解位點(diǎn)為RRFRR，與疫苗株 W93、D41的裂解識(shí)別位點(diǎn)相同。和50株國(guó)內(nèi)外代表及常用疫苗株的S1基因序列進(jìn)行了比較，同源相似性為64.7%～99.4%；與同一基因型的參考毒株CK/CH/HN/HN99等間相似性較高，為99.5%，與目前我國(guó)常用疫苗 Mass型的疫苗毒株相似性偏低，與 H120和H52之間的相似性僅80%～82.2%。

圖1 分離株S1基因te’xRT-PCR鑒定電泳圖

圖2 分離株S1全長(zhǎng)基因RT-PCR擴(kuò)增電泳圖

序列分析表明，與其他參考毒株相比，分離株CK/GD/180/2017的S1基因核苷酸序列存在大量的點(diǎn)突變， 還伴有堿基的插入、缺失現(xiàn)象，僅在少數(shù)區(qū)域相對(duì)保守，主要集中在19～25、116～120位氨基酸處變異。IBV中和抗體產(chǎn)生相關(guān)的抗原位點(diǎn)分別位于S1蛋白的第24～61、第132～149，第291～398處氨基酸。相關(guān)區(qū)域的抗原存在氨基酸突變、插入、缺失現(xiàn)象，這可能導(dǎo)致病毒抗原性和血清型的改變，并導(dǎo)致免疫失敗。

3 S1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系分析

圖3 IBV S1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

將測(cè)定的分離株CK/GD/180/2017的核苷酸序列與參考毒株構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(結(jié)果見(jiàn)圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括標(biāo)準(zhǔn)毒株在內(nèi)，所有毒株共分為9個(gè)基因型（LX4株、QXIBV株等組成I群；英國(guó)分離株4/91與UK/7/93組成基因II群；河南分離株 CK/HN/HN99 等組成基因III群；廣東分離株CK/CH/GD/ZJ10/2013、HN08株組成基因Ⅳ群、臺(tái)灣分離株 TW2575/98 和TW2296/95等組成V群；CK/CH/GX/NN11-4株等組成基因Ⅵ群； JASS株等組成的基因Ⅶ群，腎型分離株 ARK99 株、Holte 株等組成Gray型，疫苗株H120等代表的 Mass型），其中CKGD/180/2017屬于基因Ⅲ群，與H120代表的 Mass型疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

三、討論

在本研究中，同一分支的參考毒株與CK/GD/180/2017屬于基因型Ⅲ群，其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列具有高度同源性，分別在91.9%～99.4%和93.9%～99..4%之間，裂解位點(diǎn)RRFRR，是否發(fā)生重組，是否因?yàn)榛虻耐蛔內(nèi)笔Р迦氍F(xiàn)象，導(dǎo)致其毒力和致病性增強(qiáng)和組織嗜性發(fā)生改變，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。病毒中和抗體和血凝抑制抗體都是S1基因誘導(dǎo)產(chǎn)生，并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，所以常用S1基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系、序列分析來(lái)研究IBV的流行趨勢(shì)。

目前廣東省內(nèi)普遍使用的主要是Mass型H120和H52疫苗，但由于IBV基因組傳播過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致多種基因型及血清型毒株的產(chǎn)生，如果地方流行毒株和疫苗毒株的血清型不一致，僅用單一或兩個(gè)血清型的疫苗，就不能有效的保護(hù)，不同血清型之間僅有部分或完全沒(méi)有交叉免疫保護(hù)，發(fā)病的情況仍然出現(xiàn)。因此此分離鑒定地方流行的血清型毒株，對(duì)其特性的研究來(lái)進(jìn)行本地的防控。

（略）