徐璐/中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE國家豬瘟參考實驗室

診斷試劑的研發(fā)

徐璐/中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE國家豬瘟參考實驗室

診斷試劑的研發(fā)過程，就是對所有可能影響檢測結(jié)果的因素進行不斷完善的方法確認過程。

一、方法的可行性

1.操作方法的確定。根據(jù)已有的材料和技術(shù)確定操作方法，并在現(xiàn)有的方法上進行改進。

2.對照樣本的選擇。陽性對照品選強、中、弱三種。

3.數(shù)據(jù)處理方法的確定。確定影響結(jié)果穩(wěn)定性的因素；是否定量（包括相對定量和絕對定量）。

4.方法重復性的確定。方法是否穩(wěn)定，是否具有不可控的影響因素；反應(yīng)條件是否苛刻，能否通過規(guī)范化操作予以克服。

5.方法的優(yōu)化。要考慮所有影響反應(yīng)的因素，包括濃度、體積、時間、加樣順序等。

二、方法操作特性的確定

高傳染性、低致病性疾病通常將閾值設(shè)置的高一些，會提高其特異性，避免出現(xiàn)假陽性；高致病性疾病要降低臨界值，避免出現(xiàn)假陰性動物，此方法會降低疫病傳播的可能性，但也會造成特異性的降低。

陰陽性臨界值的確定：對已經(jīng)確診的陽性和陰性進行檢測，以檢測結(jié)果的區(qū)段作為橫坐標，以相應(yīng)的樣本數(shù)量為縱坐標，做曲線圖；陽性與陰性的曲線存在不同程度的重疊區(qū)域。

確定臨界值的有效工具——ROC曲線。ROC曲線指受試者工作特征曲線，以敏感性為縱坐標，1-特異性為橫坐標繪制成曲線，是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標，揭示敏感性和特異性的相互關(guān)系。（Youden指數(shù)=敏感性+特異性-1）

三、方法操作特性

1.敏感性。（1）分析敏感性：被分析物可檢出的最小劑量，即靈敏度，可用終點稀釋法進行確定；（2）診斷敏感性：檢測陽性樣本占真陽性樣本的比例；檢測結(jié)果為陰性的陽性樣本為假陽性。建議樣本量不應(yīng)少于500～1000，并且應(yīng)在目的群里隨機采樣。

如何篩選陽性樣本。采用統(tǒng)計學方法，對一群混合樣本（數(shù)千份）進行檢測，并將檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。如果檢測結(jié)果能夠明顯的分在兩個區(qū)域，即陽性與陰性分在不同的區(qū)域，則可以間接的說明該方法得到了臨床檢測樣本的預(yù)期結(jié)果。

2.特異性。（1）分析特異性：被分析物與其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)程度；（2）診斷特異性：檢測陽性樣本占真陰性樣本的比例。檢測結(jié)果為陽性的陰性樣本為假陽性。建議的樣本量為1000～5000，并且應(yīng)在目的群里隨機采樣。

3.重復性。是用本方法在正常和正確操作情況下，由同一操作人員，在同一實驗室內(nèi)，使用同一儀器，并在短期內(nèi)，對相同試樣所做多個單次測試結(jié)果，在95%概率水平兩個獨立測試結(jié)果的最大差值。

4.重現(xiàn)性。指在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度。

5.符合率。待評價方法判定的結(jié)果與金標準方法的結(jié)果相同的數(shù)占檢測樣本總數(shù)的比例（金標準：指一種或一套用于準確確定感染和非感染的方法）。

6.一致性。待評價方法判定的結(jié)果與另一種診斷方法的結(jié)果相同的數(shù)占檢測樣本總數(shù)的比例。

四、在使用過程中對該方法使用效果的持續(xù)監(jiān)測

1.保存期實驗。至少3批診斷制品的保存期實驗報告，包括各主要試劑的保存期實驗報告。

2.臨床實驗。臨床實驗中使用的制品應(yīng)不少于3批，臨床樣品檢測數(shù)量不少于1 000份，犬貓等寵物樣品檢測數(shù)量不少于500份，臨床樣品中應(yīng)包括陰性樣品，陽性、弱陽性樣品，其檢測結(jié)果需用其他方法確認。

五、保存期的確定

與原始的成品檢驗數(shù)據(jù)進行比較，保存期的定期=能夠達到質(zhì)量標準的最長期限-3個月。對預(yù)期保存期不到12個月的獸用生物制品，在前3個月內(nèi)應(yīng)每個月進行一次檢測，以后每3個月檢測一次，對預(yù)期保存期超過12個月的，在保存期的前12個月內(nèi)應(yīng)每3年進行一次檢測，在第二年中每6個月進行一次檢測，以后每年進行一次檢測。

六、臨床實驗

1.獸醫(yī)診斷制品及注冊分類及注冊資料要求。（1）應(yīng)不少于3批；（2）臨床樣品檢測數(shù)量不少于1000份，犬貓等寵物樣品檢測數(shù)量不少于500份；（3）臨床樣品中應(yīng)包括陰性樣品，陽性、弱陽性樣品；（4）其檢測結(jié)果需用其他方法確認。

2.獸用診斷制品試驗研究指導原則。（1）必要時進行適應(yīng)性試驗；（2）至少3批試劑盒；（3）至少3個可代表不同地理位置的實驗室。

六、試劑盒檢測結(jié)果統(tǒng)計

豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒對臨床樣本檢測結(jié)果的陽性率為80.96%，陰性率為85.90%；對比試劑盒檢測結(jié)果的陽性率為67.07%，陰性率為78.72%。以臨床樣本的免疫背景作為參考依據(jù)，豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的敏感性和特異性均優(yōu)于對比試劑盒。選用兩種ELISA抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果不符合樣本282份，采用中和實驗方法進行驗證，比較中和實驗與兩種試劑盒的符合率，結(jié)果豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒與FVNT的符合率為69.26%，對比試劑盒與FVNT的符合率為28.62%。

七、診斷試劑盒的前景和發(fā)展方向

1.標記疫苗、基因工程疫苗、亞單位疫苗可作為鑒別診斷試劑。

2.隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，高度集成、自動化的儀器診斷是未來診斷的發(fā)展方向。

診斷試劑操作簡單、快速、便于普及，滿足了基層客戶的個性化需求。