王琴/中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實驗室

豬瘟防控凈化技術(shù)研究

王琴/中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實驗室

一、豬瘟流行病學研究進展

（一）豬瘟在國際上的流行情況

目前已宣布無豬瘟的有以下國家和地區(qū)：

澳大利亞 法國 墨西哥 斯洛伐克奧地利 德國 新喀里多尼亞 斯洛文尼亞比利時 新西蘭 西班牙 加拿大愛爾蘭 挪威 瑞典 智利意大利 巴拉圭 瑞士 捷克共和國日本 波蘭 荷蘭 丹麥列支敦士登 葡萄牙 英國 芬蘭盧森堡 羅馬尼亞 美國 巴西部分區(qū)域哥倫比亞部分區(qū)域

（二）我國政府高度重視豬瘟凈化

根據(jù)《國家中長期動物疫病防治規(guī)則（2012-2020）》和《全國獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)則》確定的動物疫病防治總體目標與任務(wù)，豬瘟作為我國優(yōu)先防治和重點防范的16種動物疫病之一，應(yīng)對我國豬瘟的凈化和防控提出指導(dǎo)性意見和具體的凈化策略。明確提出了以下兩點：豬瘟在2015年部分區(qū)域達到凈化標準，原種豬場達到凈化標準；2020年進一步擴大凈化區(qū)域，全國所有種豬場達到凈化標準。

二、豬瘟分子流行病學研究進展

（一）研究概況

歷時37年，采集了1979-2016年的豬瘟研究數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)遍布中國大陸的31個省自治區(qū)，將近覆蓋了98%的國土面積，收集到中國大陸868條數(shù)據(jù)信息（包括中國臺灣?。?yōu)化并且標準化歐盟豬瘟病毒E2基因RT-nPCR方法擴增豬瘟病毒E2基因主要區(qū)域的271bp的片段（與軍事獸醫(yī)研究所涂長春教授合作）。

（二）C株疫苗的研究

通過C株疫苗對我國豬瘟流行毒株的免疫保護試驗數(shù)據(jù)來看，我國豬瘟流行毒株與疫苗株的同源性都在81.7%以上。

采用RID、7500RID、0RID三個免疫劑量免疫，根據(jù)結(jié)果可以看到疫苗的免疫期能持續(xù)578 d，在375d采用致死劑量的石門攻毒，可以做到完全保護。

（三）C株疫苗的研究意義

1.對闡明豬瘟病毒的遺傳變異特征和分布規(guī)律、疫情追溯、揭示病毒的遺傳進化背景具有十分重要的科學意義。

2.結(jié)合動物試驗監(jiān)測現(xiàn)行使用疫苗的有效性，提出新的防治策略也具有重要作用。

3.發(fā)現(xiàn)中國豬瘟病毒流行株基因組穩(wěn)定，并證明現(xiàn)用豬瘟疫苗對我國流行毒株能有效保護，否定了多年認為“由野毒株變異引起免疫失敗”的學術(shù)爭端，一旦監(jiān)測到野毒株低于77.2%，立即進行動物實驗驗證。

4.C株疫苗能抵抗全世界流行的三個基因型野毒的攻擊。

5.C株疫苗不僅為世界上一些國家消滅豬瘟作出了貢獻，至今對我國豬瘟控制的基本策略也是有效的。

6.對建立和豐富我國豬瘟流行病學數(shù)據(jù)庫也具有十分重要的現(xiàn)實意義。因此，實施連續(xù)的不間斷的我國豬瘟分子流行病學監(jiān)測工作是豬瘟控制的重要手段，對于制定有效防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。

（四）中國豬瘟控制成效

近年來，按照國家總體部署，堅持預(yù)防為主，實施免疫與撲殺相結(jié)合的綜合防治措施，全國豬瘟疫情得到有效控制，疫情報告起數(shù)明顯下降，流行態(tài)勢日趨平穩(wěn)，感染率較低，防控工作取得顯著成效。

據(jù)監(jiān)測，2015年全國豬場個體感染率0.15%；OIE國家豬瘟參考實驗室今年對中國重點檢測區(qū)域沒有監(jiān)測到陽性疾病。

（五）中國豬瘟控制的新目標和任務(wù)

2016年7月，農(nóng)業(yè)部財政部聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于調(diào)整完善動物疫病防控支持政策的通知》，自2017年起從中央層面退出對豬瘟的財政補助。

2017年3月，農(nóng)業(yè)部印發(fā)《國家豬瘟防治指導(dǎo)意見（2017-2020年）》，標志著正式將豬瘟免疫凈化付諸行動，這是我國豬瘟防控政策歷史性的重大轉(zhuǎn)變。

三、豬瘟診斷技術(shù)研究進展

1.豬瘟病原學診斷方法的原則

（1）診斷方法必須達到特異、敏感、快速、重復(fù)性好、結(jié)果易判定的標準；（2）早期確診，避免傳播風險；（3）持續(xù)感染呈現(xiàn)的非典型臨床表現(xiàn)和病理變化，需要靈敏的檢測方法；（4）全面的疫苗防控政策，需要鑒別感染豬與免疫豬；（5）與其他豬病的混合感染，也需要建立鑒別診斷技術(shù)。綜上所述就是必須依照實驗室診斷方法，提升診斷水平。

2.豬瘟病原學診斷方法

（1）經(jīng)典的豬瘟病原學診斷方法：動物接種試驗（很少使用）、病毒分離技術(shù)、熒光抗體檢測技術(shù)（FAT）/免疫過氧化物酶檢測技術(shù)（IPT）、抗原捕獲-ELISA；

（2）分子診斷技術(shù)：PT-PCR技術(shù)（診斷和基因分型）、熒光定量RT-PCR技術(shù)（歐盟豬瘟參考實驗室診斷標準）、恒溫擴增技術(shù)（NASBA，LAMP）；

（3）病毒中和實驗：體外病毒中和實驗（VNT）、熒光抗體病毒中和實驗（NIF）（國際貿(mào)易指定試驗）、過氧化物酶聯(lián)中和試驗（NPLA）（國際貿(mào)易指定試驗）、體內(nèi)病毒中和試驗、豬瘟病毒兔體中和試驗、豬瘟病毒豬體中和試驗；

（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：豬瘟病毒簡介ELISA抗體檢測方法（國際貿(mào)易指定試驗，是我國第一個獲得新獸藥證書的豬瘟病毒ELISA抗體診斷試劑盒）、豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法（國際貿(mào)易指定試驗）、豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測技術(shù)（ELISA）；

（5）其他常規(guī)診斷方法：豬瘟間接血凝試驗（IHA）、免疫芯片技術(shù)。

3.豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測試劑盒

（1）化學發(fā)光酶免疫分析技術(shù)（CLIA）。CLIA是一種集靈敏的化學發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測定技術(shù)于一體的檢測技術(shù)，具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速、安全穩(wěn)定和自動化程度高等優(yōu)點。中國獸藥監(jiān)察所OIE豬瘟參考實驗室與萊普生合作，經(jīng)過2年的研究，采用一步競爭法建立了豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測試劑盒。以真核表達的E2蛋白作為包被物包被聚苯乙烯發(fā)光板（抗原包被板），加待檢血清和E2蛋白單克隆抗體酶結(jié)合物后反應(yīng)30min，經(jīng)洗滌后加入發(fā)光底物，讀取發(fā)光值，回算出豬瘟抗體計量值，從而反應(yīng)出豬血清中豬瘟抗體含量，判斷陰陽性結(jié)果。因此，待檢血清中豬瘟抗體的濃度與發(fā)光值成反比。

（2）靈敏性實驗。豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測試劑盒對200份豬瘟抗體陽性血清進行檢測，同時用I-ELISA和B-ELISA試劑盒進行平行實驗，化學發(fā)光抗體檢測試劑盒的敏感性平均為95.8%，比I-ELISA和B-ELISA高出3～5個百分點。

（3）優(yōu)勢。豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測試劑盒是繼傳統(tǒng)ELISA技術(shù)之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)，其優(yōu)勢體現(xiàn)為進一步優(yōu)化了顯色系統(tǒng)，用發(fā)光底物代替了傳統(tǒng)的TMB底物，提高了檢測的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，預(yù)測會取代傳統(tǒng)ELISA。該試劑盒的優(yōu)勢有：①標記分子小，標記物非常穩(wěn)定；②發(fā)光時間長，靈敏度高；③光信號線良好，動力學范圍寬，超過6個數(shù)量級；④重現(xiàn)性好；⑤通過校準設(shè)置，使試劑盒的檢測結(jié)果實現(xiàn)了相對定量；⑥實現(xiàn)了全自動化；⑦方便快速。由于本試劑盒采用一步競爭法，血清無需稀釋，使工作更加簡便快速，檢測時間大大縮短。

4.豬瘟免疫失敗原因分析

豬瘟依然在我國散發(fā)存在，造成免疫失敗的原因主要有以下幾方面。

（1）豬瘟持續(xù)感染帶毒豬。

（2）個別豬體免疫功能異常。

（3）母源抗體對疫苗免疫的影響。

（4）免疫程序不科學。

（5）部分廠家豬瘟疫苗質(zhì)量。

（6）疫苗運輸?shù)睦滏溝到y(tǒng)不完善。

（7）多種病混合存在。

（8）診斷方法不特異。

四、我國豬瘟凈化存在的挑戰(zhàn)

（一）豬瘟防治思路

1.以預(yù)防為主的防控方針。

2.以源頭控制、分類指導(dǎo)、梯度推進為防治原則—種群凈化。

3.以養(yǎng)殖場（戶）為防治主體。

4.以疫病凈化為防治重點，不斷完善養(yǎng)殖場生物安全體系。

5.嚴格落實免疫預(yù)防、監(jiān)測凈化、檢疫監(jiān)管、應(yīng)急處理、無害化處理等綜合防控措施。

6.積極開展場群或區(qū)域凈化工作，降低發(fā)病率，壓縮流行范圍，有效清除病原，逐步實現(xiàn)凈化。

7.加強區(qū)域管理，建設(shè)無豬瘟區(qū)和無豬瘟生物安全隔離區(qū)（無豬瘟企業(yè)）。

8.評估驗收流程：示范場—縣級主管部門—地級主管部門—省級主管部門—國家疫控中心。

（二）我國豬瘟保障措施

1.加強組織領(lǐng)導(dǎo)，地方各級人民政府對轄區(qū)內(nèi)豬瘟防治工作負總責。

2.強化技術(shù)支撐，要依靠地方各級動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)，豬瘟實驗室的技術(shù)力量，發(fā)揮專家委員會作用，分析流行動態(tài)，加強技術(shù)指導(dǎo)，提出政策措施建議，為防治工作提供技術(shù)支撐。

3.各級畜牧獸醫(yī)部門要與豬瘟實驗室密切配合，積極開展監(jiān)測和流行病學調(diào)查工作，發(fā)展病原學陽性樣品應(yīng)及時送豬瘟實驗室進行分析鑒定，及時掌握病原變異情況。

4.中國獸藥監(jiān)察所要加強豬瘟疫苗和診斷制品質(zhì)量監(jiān)管以及疫苗免疫效果評估。豬瘟實驗室要及時借鑒國際疫情監(jiān)測及預(yù)警先進經(jīng)驗，建立完善豬瘟疫情監(jiān)測預(yù)警模型和數(shù)據(jù)庫，持續(xù)跟蹤病原遺傳演化規(guī)律、病原分布、疫情動態(tài)，分析疫苗毒株與流行毒株的匹配性，監(jiān)測疫苗的臨床免疫效果，加強新型疫苗和診斷試劑等技術(shù)研究，提出防控對策建議。

5.強化政策保障。

6.落實經(jīng)費保障。

7.加強宣傳和國際合作。

（三）我國豬瘟凈化技術(shù)支撐

1.技術(shù)支撐?？焖倜舾械脑\斷技術(shù)已經(jīng)達到國際技術(shù)標準，并被國際上認可，為凈化提供了技術(shù)支持。

2.理論基礎(chǔ)。通過對豬瘟分子流行病學的研究，病毒基因組穩(wěn)定，變異頻率低，只有一個血清型，對該病毒的清除是一個有利的條件。

3.疫情預(yù)警。建立完善豬瘟疫情監(jiān)測預(yù)警模型和數(shù)據(jù)庫，持續(xù)跟蹤病原遺傳演化規(guī)律、病原分布，疫情動態(tài)，分析疫苗毒株與流行毒株的匹配性，監(jiān)測疫苗的臨床免疫效果。

4.技術(shù)保障。豬瘟疫苗依然是最優(yōu)秀的疫苗，為豬瘟的控制提供了技術(shù)保障。

5.標記疫苗。是我國豬瘟疫苗的急需產(chǎn)品。

根據(jù)以上技術(shù)支持，建立了豬瘟綜合防控凈化模式，中國豬瘟凈化，將不再只是一句空談，是切實可以實現(xiàn)的。