王雅琴 張海云 唐艷榮 楊 榮 張曉梅 許東保 張長林 曹院章

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100018）

2016年朝陽區(qū)動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)人畜共患病流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告

王雅琴 張海云*唐艷榮 楊 榮 張曉梅 許東保 張長林 曹院章

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100018）

本文對動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)中因不同的原因前來就診的寵物進(jìn)行采樣，調(diào)查其可能的人畜共患病的攜帶情況。通過動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)共計(jì)采樣286份，應(yīng)用 V8實(shí)時(shí)快速熒光PCR檢測設(shè)備，進(jìn)行布魯氏菌病、鉤端螺旋體病、弓形體病的快速檢測；其中布魯氏菌病未檢出；弓形體病檢測出陽性占比8.2%；鉤端螺旋體病陽性占比3.6%；

流行病學(xué)調(diào)查 就診寵物犬 布魯氏菌病 鉤端螺旋體病 弓形體病 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

0 引言

城市生活中，寵物的飼養(yǎng)既是一種精神需求，也是一種生活方式。在人們關(guān)注身心健康的同時(shí)，不可避免的重視所飼養(yǎng)動(dòng)物可能引發(fā)的人畜共患傳染病的可能。

所以本次調(diào)研項(xiàng)目，旨在通過定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)中的就診病例，采集樣品，開展涉及布魯氏菌病、弓形體病、鉤端螺旋體病的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。調(diào)查臨床病例中可能攜帶的人畜共患病比例。通過現(xiàn)場調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室檢測相結(jié)合的方式，動(dòng)物疫病進(jìn)行定期定點(diǎn)抽樣調(diào)查，經(jīng)對各類資料和數(shù)據(jù)綜合分析、有效評估免疫效果、病原污染程度等技術(shù)指標(biāo)，從而提出防控建議和預(yù)測預(yù)警。提高寵物飼養(yǎng)帶來的健康危害、經(jīng)濟(jì)損失以及潛在的風(fēng)險(xiǎn)意識。

本項(xiàng)目的流行病學(xué)調(diào)查方法采取動(dòng)物疫病定點(diǎn)流調(diào)的方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測相結(jié)合的方式，在朝陽區(qū)四個(gè)街道中的動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)中開展采樣，樣品采集的時(shí)間為2016年1月至12月，樣品冷鏈運(yùn)輸?shù)轿抑行膶?shí)驗(yàn)室，進(jìn)行V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，相關(guān)數(shù)據(jù)處理。

本項(xiàng)目的實(shí)施單位為北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，參加采樣的單位分別位于朝陽區(qū)南磨房街道、團(tuán)結(jié)湖街道、望京街道、奧運(yùn)村街道中的動(dòng)物治療機(jī)構(gòu)共計(jì)四家。同時(shí)涉及朝陽區(qū)警犬巡防隊(duì)的警用犬只。

1 材料和方法

1.1 定點(diǎn)調(diào)查的原則和范圍

1.1.1 定點(diǎn)流調(diào)的原則：每個(gè)定點(diǎn)的布局考慮到地域、交通、動(dòng)物飼養(yǎng)量、動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)的工作能力以及所采樣品充分的代表性。

1.1.2 定點(diǎn)的范圍：指針對動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)中前來就診的寵物采樣。

1.2 定點(diǎn)調(diào)查的內(nèi)容

（1）開展項(xiàng)目的動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)的完整信息調(diào)研。

（2）開展寵物樣品信息采集，內(nèi)容包括寵物主人姓名、病例號、寵物年齡、性別、品種、就診時(shí)臨床癥狀、采集樣品種類，采樣日期。

（3）開展V8實(shí)時(shí)快速熒光PCR檢測，配套專用商品化試劑盒，對布魯氏菌病、鉤端螺旋體病、弓形體病進(jìn)行快速診斷。

2 定點(diǎn)流行病學(xué)調(diào)查情況

2.1 樣品采集及運(yùn)輸要求

2.1.1 采集樣品種類：EDTA血液采集使用專用的“一次性使用人體靜脈血樣采集容器EDTA K2”生產(chǎn)日期：160406；失效日期：201803。

2.1.2 樣品保存：樣品的適當(dāng)保存是有效檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。樣品如果在三日內(nèi)完成檢測，均可以再4℃冷藏保存，超過3日再做檢測的樣品，可于-20℃冷凍保存。血液類樣品，于-20℃冷凍保存。

2.1.3 樣品運(yùn)輸：樣品要求保持冷鏈運(yùn)輸，是保證基因檢測樣品時(shí)效性的重要措施。所有樣品均需要低溫運(yùn)輸，使用樣品運(yùn)輸箱，內(nèi)部放置冰塊或者干冰。

2.1.4 樣品采集標(biāo)準(zhǔn)：EDTA血液樣品采集：選擇臨床患病動(dòng)物表現(xiàn)為呼吸困難、黃染、眼葡萄球膜炎癥的、生殖系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)問題、老年性肝腎功能異常的；血液樣品量不得少于2ml。

2.2 試驗(yàn)方法和試劑來源

2.2.1 檢測原理：實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過特定探針和引物的設(shè)計(jì)和合成，模板的制備，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。原則上將凡是已知有特異標(biāo)記的病原體都可用PCR進(jìn)行鑒定?？捎肞CR檢測的病原體包括各種細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體、寄生蟲等。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)使用儀器：

（1）V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測儀器。特點(diǎn)：快速變溫、收集熒光信號、自動(dòng)設(shè)定閾值、自動(dòng)計(jì)算Ct值。

（2）移液器。試驗(yàn)中配備的eppendorf手動(dòng)單道移液器10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl的移液器各一把。

（3）高速離心機(jī)。配備Eppendorf 高速離心機(jī)5418一臺。

（4）其他設(shè)備：配備電熱恒溫水浴鍋一臺、小型漩渦振蕩器一臺，計(jì)時(shí)器一臺，板架若干。

（5）實(shí)驗(yàn)使用的V8反應(yīng)試劑盒。共計(jì)引進(jìn)V8試劑盒92個(gè)，其中布魯氏菌病V8反應(yīng)試劑盒30個(gè)，鉤端螺旋體病V8反應(yīng)試劑盒32個(gè)，弓形蟲病V8反應(yīng)試劑盒30個(gè)。

3 檢測方法V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測操作步驟

3.1 DNA提取操作

3.1.1 消化：反應(yīng)體系中存有200μl消化液，加入經(jīng)過充分融化、震蕩混勻的樣品100μl，加入20μl蛋白酶k，震蕩混勻。于56℃水浴十分鐘，每三分鐘振蕩一次。降到室溫后，加入300μl結(jié)合液。

3.1.2 吸附：充分混勻后的反應(yīng)液，靜置3～5min，加入吸附柱中，10000 rpm、30 s中離心。

3.1.3 洗滌：加入洗滌液500μl于吸附柱中，10000 rpm、30 s中離心。棄去收集管內(nèi)液體，重復(fù)操作。棄去液體后，10000 rpm、120 s。

3.1.4 洗脫：加入洗脫液50μl，10000 rpm、30 s離心，獲得相應(yīng)的核酸模板。

3.2 核酸擴(kuò)增反應(yīng)操作

（1）取V8實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管，置于室溫融化，放置于反應(yīng)管架（溫度保持在2℃～10℃），用移液器吸取核酸模板R（D）NA5μl加入反應(yīng)管中，用離心機(jī)離心30 s，放入V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測儀器中，使用對應(yīng)的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增檢測

（2）結(jié)果判定：根據(jù)自動(dòng)分析，Ct值≤36并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為陽性樣品；Ct值>36時(shí)，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，需要重新取樣品提取核酸模板，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，結(jié)果判定為陽性樣品；對于未能呈現(xiàn)特定的“s”型曲線的，即使Ct值≤36，應(yīng)為陰性。

3.3 注意事項(xiàng)

3.3.1 預(yù)防污染

操作人員必須穿戴好工作服、口罩、手套；

提取過程中，盡量避免手套接觸吸附柱管口和離心管管口；

將液體吸入吸附柱中時(shí)，若離心管開蓋時(shí)液體粘在手上或?yàn)R出，應(yīng)立即更換手套；

所有用于檢測的廢棄物都應(yīng)該收集放入消毒液的消毒缸中。

反應(yīng)管放入儀器前，一定要蓋緊封口，放置在儀器內(nèi)崩開。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用卡夾取出時(shí)，要卡到反應(yīng)管最后一道棱框內(nèi)，放置取出過程中導(dǎo)致封口崩開，飛沫污染儀器。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)該用1%次氯酸鈉或75%酒精消毒工作臺。

3.3.2 規(guī)范操作

所有樣品必須進(jìn)行明確的標(biāo)記，編號，采樣單位制作完整的《V8項(xiàng)目檢測樣品采樣表格》，送樣品時(shí)上交《V8項(xiàng)目流行病學(xué)調(diào)查采樣登記表》。由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測號碼的編制，并且進(jìn)行標(biāo)記，排序。

所有樣品都需進(jìn)行充分的融化后進(jìn)行檢測，棉拭子以及唾液樣品檢測前需要進(jìn)行振蕩混勻。嚴(yán)禁樣品反復(fù)凍融（三次不可用）。

實(shí)際操作中，所有試劑使用前需要認(rèn)真核對檢測試劑名稱。反應(yīng)管、蛋白酶K使用前，于室溫融化，隨用隨取，用后立即放回冰箱。

所有實(shí)驗(yàn)操作完全按照操作說明書步驟操作，不得刪減。

3.4 儀器設(shè)備計(jì)量、效驗(yàn)、維護(hù)

參加由北京世紀(jì)元亨組織的V8快速實(shí)時(shí)熒光PCR能力驗(yàn)證比對實(shí)驗(yàn)，依據(jù)ISO/IEC17043、GB/T27043和SN/T2989運(yùn)作能力驗(yàn)證計(jì)劃，參與能力驗(yàn)證比對實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：比對實(shí)驗(yàn)中的四個(gè)盲樣，檢測結(jié)果均為滿意。計(jì)算中位值、標(biāo)準(zhǔn)IQR和Z比分?jǐn)?shù)，均為滿意。

3.5 影響調(diào)查研究結(jié)果和數(shù)據(jù)的條件和因素

3.5.1 樣品采集的代表性意義：動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查采樣工作，采樣人員的主觀因素影響比較嚴(yán)重，隨機(jī)性差，不具有完全的代表性。同時(shí)，也與動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)工作狀況相關(guān)，在日常工作比較繁忙的季節(jié)，采樣數(shù)量明顯較少。存在樣品采集的隨機(jī)誤差和選擇偏倚。

3.5.2 檢測水平和檢測方法效驗(yàn)誤差：V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測系統(tǒng)雖然是成熟的檢測技術(shù)，但是在實(shí)際操作過程中，對操作人員的要求較高，對各種試劑的存儲、使用都有著極為苛刻的規(guī)定，不可避免出現(xiàn)人員誤差和儀器誤差。

3.5.3 項(xiàng)目設(shè)計(jì)中的目的性偏倚：本項(xiàng)目的主旨是寵物源性人畜共患病的快速診斷檢測的應(yīng)用，針對個(gè)體動(dòng)物的疫病攜帶情況的檢測和分析，缺少對整個(gè)群體的大數(shù)據(jù)分析和考量。所以，檢測范圍小、采集樣品量少、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)少，社會意義有限。

4 結(jié)果

2016年1 月至12月期間我實(shí)驗(yàn)室共計(jì)接收到動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)送檢EDTA血液樣品286份。共計(jì)開展實(shí)時(shí)熒光PCR檢測829項(xiàng)次，其中弓形蟲檢測279份、布魯氏菌病檢測275份、鉤端螺旋體病檢測275份。

4.1 弓形蟲調(diào)查結(jié)果

共計(jì)收集EDTA犬血液樣品286份，其中279份符合實(shí)驗(yàn)要求，檢出結(jié)果為共計(jì)檢出23份陽性樣品。其中陽性樣品占比8.2%。

4.2 布魯氏菌病調(diào)查結(jié)果

共計(jì)收集EDTA犬血液樣品286份，275份符合實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)果均為陰性。

4.3 鉤端螺旋體病調(diào)查結(jié)果

共計(jì)收集EDTA犬血液樣品286份，275份符合實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)果共計(jì)檢出陽性樣品10份，占比3.6%。

5 結(jié)論

在2016年1月至12月期間，在朝陽區(qū)的四個(gè)街道的診療機(jī)構(gòu)中采集的就診動(dòng)物樣品的檢測中，細(xì)菌類疾病犬布魯氏菌病未檢出，鉤端螺旋體病檢出率3.64%；寄生蟲類疾病弓形體病檢出率8.24%。

6 分析與討論

6.1 布魯氏菌病情況分析

我國人間布魯氏菌病現(xiàn)狀，自2007年至2015年感染人數(shù)年以來持續(xù)上升，發(fā)病區(qū)域以及感染人群都有了明顯變化。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為有以下幾點(diǎn)主要原因：（1）與社會環(huán)境有關(guān)；（2）與制度不健全有關(guān)；（3）群眾自我防護(hù)意識淡漠；（4）旅游業(yè)對布病疫情波動(dòng)的影響；（5）某些部門重視不夠，配合不協(xié)調(diào)，布病防治隊(duì)伍力量薄弱、業(yè)務(wù)素質(zhì)不高。由于人的感染持續(xù)高位增長，導(dǎo)致動(dòng)物飼養(yǎng)者對本病的關(guān)注度增加，寵物臨床病例檢測會隨著人們意識水平的提高而加以重視。

6.2 鉤端螺旋體病情況分析

鉤端螺旋體病遍布世界各地，多種動(dòng)物體內(nèi)分離出來，熱帶和亞熱帶地區(qū)流行較嚴(yán)重。鉤端螺旋體長期存在于患病動(dòng)物的腎臟中，通過尿液間歇或者連續(xù)性的排出體外，污染水體和土壤，造成環(huán)境污染。本病可經(jīng)皮膚黏膜，消化道以及胎盤垂直傳播。20世紀(jì)50～60年代曾經(jīng)在我國四川發(fā)生大流行，給廣大人民造成嚴(yán)重?fù)p害。近年來河南，黑龍江報(bào)道發(fā)生人間感染鉤端螺旋體的病例。鉤端螺旋體病流行在6～10月，發(fā)病呈單峰狀，與溫度氣候有極大的關(guān)系，同時(shí)與自然災(zāi)害相伴發(fā)生。2000年后，我國各地的發(fā)病率呈穩(wěn)步的下降趨勢[13]。北京地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，冬夏溫差大，除夏季適于本病的傳播，進(jìn)入冬季不適合本病的傳播。近年來，針對鉤端螺旋體病的疫苗在動(dòng)物臨床上廣泛使用，進(jìn)一步有效的控制本病的傳播。根據(jù)此次流行病學(xué)采樣調(diào)查，寵物鉤端螺旋體的攜帶比例3.6%。

分析原因：

首先，城市鼠患加快本病的擴(kuò)散。鉤端螺旋體的一個(gè)重要的儲存宿主-老鼠，在北京這樣的大城市分布廣、數(shù)量的、繁殖快，與寵物的交集集中在城市草坪、綠化帶、小區(qū)綠地等地，患病鼠尿液排放在草叢中，寵物通過皮膚黏膜、鼻黏膜等部位接觸到，引起感染。

其次，寵物的生活環(huán)境和快速的交通狀況有利于本病的傳播。本次檢測項(xiàng)目采樣時(shí)間集中在北京冬季，本身不適于本病的傳播，獲得3.6%的攜帶動(dòng)物比例，動(dòng)物個(gè)體的南北方調(diào)運(yùn)給本病的傳播提供了有利條件。在今后的研究和流行病學(xué)調(diào)查方向?qū)⑹且陨l(fā)病例作為本病監(jiān)測重點(diǎn)。

最后，患有本病的動(dòng)物，臨床表現(xiàn)差異較大，早期就診時(shí)容易誤診，能夠進(jìn)行相應(yīng)的血液檢查，會有明顯的白細(xì)胞變化，會指導(dǎo)動(dòng)物醫(yī)生使用抗生素治療，一般的光譜抗生素對本病都有效。

6.3 弓形體病情況分析

首先，人間感染率持續(xù)上升，與寵物飼養(yǎng)的生活方式相關(guān)。弓形體病是由弓形體感染引起的人畜共患細(xì)胞內(nèi)寄生蟲病，本病呈世界性分布，人群普遍易感。根據(jù)九十年代對我國大連地區(qū)2016人的抗體檢測重中，正常人群感染率為1.00%。根據(jù)我國2005年《全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查報(bào)告》中，北京地區(qū)的弓形蟲病感染率高于全國平均值，感染率高達(dá)9.615%[8]。同一時(shí)間深圳地區(qū)調(diào)查無償獻(xiàn)血人群680份血清標(biāo)本總體感染率為7.21%，家庭婦女組IgG感染率高于其他組別，89名被調(diào)查者中有61人家中飼養(yǎng)貓與狗之類動(dòng)物，接觸動(dòng)物可能是引起家庭婦女感染率增高的原因[8]。結(jié)合本次調(diào)查結(jié)果，犬類血液中攜帶比例高達(dá)8.2%，存在通過寵物傳染人的風(fēng)險(xiǎn)。

其次，檢測方法的改進(jìn)，更客觀的了解疫情。關(guān)于弓形體病的檢測方法主要是血清學(xué)檢測，通過測量IgG和Ig M抗體水平，來判斷個(gè)體是處于感染急性期還是隱性感染期，對于動(dòng)態(tài)的免疫抗體水平以及個(gè)體的免疫抑制、免疫缺陷等情況檢測方法的偏差始終存在。本項(xiàng)目試驗(yàn)通過進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法對弓形體的檢測，能夠?qū)毙云诨螂[形感染的動(dòng)物進(jìn)行判定，還能夠?qū)崿F(xiàn)對免疫抑制和免疫缺陷的動(dòng)物的檢測，不受動(dòng)物體自身免疫系統(tǒng)疾病的影響，更加客觀的體現(xiàn)弓形體病在寵物犬的攜帶情況。

再次，為了深入了解本病，仍需擴(kuò)大檢測動(dòng)物種類。貓和其他貓科動(dòng)物是弓形體的終末宿主，它寄生在這些動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)，隨形成的糞便排出體外，感染其他動(dòng)物體。在此次項(xiàng)目中采樣以犬的血液樣品為主，所以，關(guān)于弓形體的檢測仍然需要擴(kuò)大采樣范圍，增加采樣數(shù)量，才更客觀有效。

最后，開展動(dòng)物飼養(yǎng)者的有效教育。弓形體病有有效的治療方法，但是治療時(shí)間長，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，同時(shí)患病動(dòng)物沒有強(qiáng)烈的臨床癥狀，導(dǎo)致動(dòng)物主人的不信任以及不配合，所以需要臨床獸醫(yī)進(jìn)行更多的溝通和教育。

[1]侯加法，鄧譯峰.寵物犬貓常見人畜共患病[J].新獸醫(yī)，2005，（7）：34-36.

[2]周艷彬，柳曉琳.布魯氏菌病的流行、發(fā)病原因及防治進(jìn)展[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（1）：81-85.

王雅琴（1978-），女，獸醫(yī)師，從事多年人畜共患病研究及實(shí)驗(yàn)室檢測。

張海云（1964-），女，高級獸醫(yī)師，從事多年人畜共患病研究。