韋中強++韓如剛++李娜++韓量++秦靜

摘要 采用菌根應用技術，對黃精根系VA真菌的侵染情況及其對黃精生長效應的影響進行研究。結(jié)果表明，從黃精根際土壤分離到地球囊霉和摩西球囊霉菌根真菌，土壤含孢量為20.6個/g；黃精根系AM真菌菌絲感染率為17.4%、叢枝感染率為3.1%、泡囊成群分布；孢子接種量不同，黃精生長效應存在差異，說明黃精對VA菌根真菌存在依賴性。

關鍵詞 VA菌根；黃精；侵染情況；生長效應；影響

中圖分類號 S567.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）19-0057-02

VA菌根是一種常見的內(nèi)生菌根，因其菌絲體在胞內(nèi)呈叢枝狀（Arbuscular）和泡囊狀（Vese-icular）而得名[1]。由于部分真菌產(chǎn)生叢枝但不產(chǎn)生泡囊，故統(tǒng)稱為叢枝菌根（AM）。我國VA菌根真菌廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境中，資源豐富，生態(tài)適應性強。其能與絕大多數(shù)植物共生，有促進水分和養(yǎng)分吸收利用、提高抗病性、增強耐鹽堿和重金屬的耐性、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)，對于實現(xiàn)植物根際土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的實踐價值[2]。

黃精[Polygonatum cirrhifolium（Wall.）Royle]為百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根莖。別名老虎姜、雞頭參，始載于《名醫(yī)別錄》，列為上品，黃精味甘，性平。歸脾、肺、腎經(jīng)。具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎功能。其性平和，作用緩慢，可作久服滋補之品，自古以來一直被視為延年益壽的珍貴中藥，是老年人較理想的補養(yǎng)之品。作為傳統(tǒng)名貴中藥，近年來，由于黃精新藥研制和保健品開發(fā)，而野生資源缺乏，人工栽培黃精已成為供求主體。本文對黃精根系VA真菌的侵染情況進行研究，觀察其對黃精生長的影響?，F(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物。黃精，采自重慶南川三泉鎮(zhèn)境內(nèi)自然環(huán)境生長的新鮮植株，同時采集其根際土壤。由重慶市藥物種植研究所提供黃精有性種子。

1.1.2 供試菌劑。AM菌劑孢子是課題組采用“濕篩傾析法”分離[3]，在體視顯微鏡下，從黃精根際土壤0～30 cm深處的土壤中挑取而得。

1.1.3 供試土壤。質(zhì)地為砂壤土，含速效磷3.22 mg/kg、速效氮52.87 mg/kg、有機質(zhì)2.01%、速效鉀104.8 mg/kg、pH值6.7。土壤田間含水量為18%。土壤經(jīng)高壓濕熱滅菌（θ=121℃ φ=0.1 MPa）2 h，冷卻備用。每缽裝2 kg滅菌土。供試盆栽缽為棕色塑料常規(guī)盆栽缽。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃精AM菌根侵染調(diào)查。①根樣采集。將根樣洗凈，將須根先端約1 cm的根段剪下，放入FAA固定液中進行固定，保存?zhèn)溆?。②染色制片。根?jù)參考文獻[4]中介紹的方法進行制片。③菌根感染率的測定。用測微尺測定感染根段長（含有VA真菌菌絲、泡囊、叢枝、孢子之一者為感染根段）。用Kuwada長度測量軟件測量根段長，計算公式[5]如下：

菌根感染率（%）=（VA菌根感染根段長÷觀察根段長）

侵染等級劃分標準：菌根侵染率0%～5%為1級；6%～25%為2級；26%～50%為3級；51%～75%為4級；76%～100%為5級。

將制片移至Olympus顯微鏡下進行照相，便于觀察清晰的泡囊、菌絲、叢枝、孢子或分枝狀吸收結(jié)構(gòu)等，并做好記錄。

1.2.2 黃精根際土壤AM真菌含孢量測定及分離鑒定。取帶根土樣進行混合陰干，稱取3份各100 g，用濕篩傾析法分離孢子，將獲得的濕篩孢子混合物洗入培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下統(tǒng)計計數(shù)，計算每1 g陰干土中的孢子數(shù)量。在解剖顯微鏡下依據(jù)孢子形態(tài)、大小及顏色初步歸類，將同類孢子用毛細管或粘有水的拔針轉(zhuǎn)移到載玻片上，將孢子調(diào)整到最佳位置，再觀察孢子的顏色、形狀及大小。后加蓋玻片將孢子壓破，在顯微鏡下觀察孢壁總厚度、連孢菌絲等特征，參照Schenck和Perez（1988）的VA菌根手冊進行分類鑒定。

1.2.3 黃精盆栽接種AM真菌對生長效應的影響。將濕篩傾斜法分離提取的真菌孢子，在體視顯微鏡下挑取細胞質(zhì)均勻一致的生活AMF孢子，42 kHz超聲水浴振蕩片刻去掉孢子表面雜物，蒸餾水漂洗數(shù)次后，將孢子轉(zhuǎn)入Φ 3.0 cm的小玻璃培養(yǎng)皿中，滴加5%氯化銨T-0.04%鏈霉素-吐溫20液[5]，蓋好上皿，孢子表面消毒15 min，滅菌蒸餾水漂洗干凈，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別采用200、400、800、1 200個AMF孢子接種1 kg土壤，以滅菌土壤不接種作對照（CK），3次重復，每缽播種3粒黃精種子，播期2015年2月10日，播后覆土，滅菌蒸餾水澆透。出苗時定苗1株，常規(guī)管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精AM菌根形態(tài)觀察

由圖1可知，黃精叢枝菌根根內(nèi)孢子呈圓形或近圓形，顯微鏡下呈淺黃色，表面光滑；泡囊近橢圓形，顏色較深。觀察到根內(nèi)孢子，但相對較少，而泡囊作為營養(yǎng)繁殖體較為豐富。從制片觀察到黃精根內(nèi)菌絲和叢枝分布稀疏，叢枝相對更少。根據(jù)計算結(jié)果，菌絲和叢枝感染率分別為17.4%、3.1%。由此表明，VA菌根真菌侵染黃精幼根形成了菌根，為菌根藥用植物，但感染率不高，這可能與土壤性質(zhì)、植物本身性質(zhì)及VA真菌資源等有關，有必要開展AM真菌接種試驗。

2.2 黃精根際土壤AM菌根真菌孢子密度及種類

統(tǒng)計結(jié)果表明，每1 g土壤中含有20.6個孢子，根據(jù)其形態(tài)、顏色及大小分為2類：一類孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)描述為：孢子單生，黃棕色，近圓形，大小250～280 μm。孢壁光滑，孢壁總厚度11 μm，可分3層：外層無色透明，厚約1 m，成熟后常脫落；第2層黃棕色層狀壁，8 μm；最內(nèi)層淡黃色膜狀壁，厚約1 μm，連孢菌絲淡黃色或淡黃棕色，直桶形，菌絲寬13～26 μm。連點處有隔，由內(nèi)壁封閉；另一類孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)描述為孢子單生，棕色，圓形，孢子表面光滑，大小160～260 μm，孢子壁2層，外層為淺黃色層狀壁，厚5 μm，總厚度10 μm。2層緊貼在一起不易分開。連點寬26 μm，距連點下方5 μm有加厚呈柱狀的菌絲壁（基部微喇叭形），連絲內(nèi)部有厚—凹形彎隔。根據(jù)鑒定結(jié)果，該孢子為地球囊霉（G. geospora Gerdemann，J.W and J.M.Trappe）和摩西球囊霉（G.mosseae Gerd&Trappe），地球囊霉孢子和摩西球囊霉孢子平均每1 g土壤含14.4個和6.2個，分別占總數(shù)的69.90%和30.10%。黃精根際土壤AM真菌種群豐度為2（種群豐度—指一個中藥材根際土壤中所含VA菌根真菌種的數(shù)量）。endprint

2.3 AMF真菌孢子不同接種量對黃精生長效應的影響

在黃精生育期，于2015年11月25日調(diào)查黃精生長狀況，對黃精的株高、葉面積、單株重量進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1、圖2可知，接種AM真菌處理較對照黃精在生長量方面有所提高，說明AM真菌對黃精的生長有促進作用，黃精對AM真菌存在一定的依賴性。其中，處理C即接種密度為800個孢子/kg土壤時，黃精單株重量達到了2.96 g，較CK增產(chǎn)193.06%。由表1、圖3可知，接種AM真菌處理較對照黃精生長良好，植株旺盛，在株高方面顯現(xiàn)出優(yōu)勢，說明接種AM真菌有助于黃精根系吸收土壤營養(yǎng)，促進藥用植物黃精植株快速生長。

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，不接種處理黃精的生長效應相對較差，不管是株高、葉片面積和單株產(chǎn)量都明顯低于接種AMF真菌孢子處理的。說明黃精對AMF存在依賴性，隨著接種孢子數(shù)量的增加，黃精的生長效應表現(xiàn)更加明顯，當接種孢子密度達800個孢子/kg土壤時，黃精株高、葉片面積、單株產(chǎn)量均達最高，但當接種孢子密度達1 200個孢子/kg土壤以上時與接種孢子密度達800個孢子/kg土壤時沒有顯著差異，說明隨著孢子數(shù)量的增大，接種過高密度的AM真菌時，菌根就會發(fā)生由共生關系轉(zhuǎn)向寄生關系，對植物的生長帶來一定負效應。

目前，菌根生物技術是實現(xiàn)經(jīng)濟、生態(tài)和社會三效益發(fā)展的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)新模式的新途徑之一。我國的菌根資源相當豐富，但對菌根的研究起步較晚，自20世紀50年代后，才開始菌根研究，并陸續(xù)引種和大規(guī)模造林工作。目前，許多農(nóng)業(yè)科研機構(gòu)和農(nóng)業(yè)院校等相繼開展了叢枝菌根相關研究課題，使VA菌根研究從實驗室階段開始轉(zhuǎn)向生產(chǎn)應用及推廣階段，其研究的深度和廣度也得到了進一步提高。而渝主產(chǎn)藥材VA菌根資源調(diào)查研究除了李品明等[6]人外，還尚未有其他人涉足。本試驗對重慶市主產(chǎn)中藥材黃精叢枝菌根的菌絲感染率、叢枝感染率、泡囊數(shù)量等級進行了測量和統(tǒng)計，以及土壤含孢量測定和AM真菌種類鑒別。并采用菌根應用技術，開展了AM真菌接種試驗，觀察菌根真菌對黃精的生長效應，接種一定數(shù)量的AM真菌可顯著提高黃精的產(chǎn)量。本試驗結(jié)果可為進一步對藥用植物黃精菌根的深入研究以及菌根生物技術在中藥材生產(chǎn)上的廣泛應用提供科學依據(jù)，并打下堅實的理論基礎[7-8]。

4 參考文獻

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[2] 陳敏，王和勇，廖志華，等.發(fā)根農(nóng)桿菌介導的藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12（3）：98-102.

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] 劉潤進.叢枝菌根及其應用[M].北京：科學出版社，2000：1-45.

[5] 楊曉紅，曾明，李道高，等.叢枝菌根真菌的垂直平板定時轉(zhuǎn)動培養(yǎng)及菌絲生長觀察[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（3）：358-361.

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[8] 字肖萌，高江云.不同真菌對2種藥用石斛種子共生萌發(fā)的效應[J].中國中藥雜志，2014，39（17）：3238-3244.endprint