石境懿，夏 利，張 衡，朱書瑤

(四川省婦幼保健院新生兒科，四川 成都 610032)

·論著·

rhu-EPO輔助治療對新生兒缺氧缺血性腦病氧化應激損傷及Caspase-3、ACT A水平的影響

石境懿，夏 利，張 衡，朱書瑤

(四川省婦幼保健院新生兒科，四川 成都 610032)

目的探討重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhu-EPO)輔助治療對新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopath，HIE)氧化應激損傷及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic protease-3，Caspase-3)、內(nèi)源性激活素A(endogenous activin A,ACT A)的影響。方法將130例HIE患者隨機分為A組(rhu-EPO輔助常規(guī)治療)與B組(常規(guī)治療)各65例，并選擇65例同期健康新生兒納入C組，比較A組與B組在治療效果、不良反應率差異及3組在治療當天、治療1周、治療4周時超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、Caspase-3、ACT A、新生兒神經(jīng)行為測定(neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)的差異。結果A組療效(92.3%)高于B組(70.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同時間點C組SOD、MDA、Caspase-3、ACT A水平無顯著變化，而A、B組SOD水平顯著增高，3組在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A、B組ACT A水平逐漸增高，且B組高于A、C組，3組在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A、B組Caspase-3呈先升高后降低的趨勢，3組在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A、B組MDA水平逐漸下降，3組在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A、B組NBNA評分逐漸升高，3組在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組不良反應發(fā)生率(7.7%)低于B組(30.8%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論Capspase-3及ACT A均參與HIE病理生理過程，且通過rhu-EPO輔助治療HIE，有利于降低該病氧化應激損傷及Caspase-3、ACT A水平。

缺氧缺血，腦；重組人促紅細胞生成素；嬰兒，新生

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.013

新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是我國新生兒中致殘率及病死率較高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病機制與圍產(chǎn)期新生兒窒息及缺氧引起的氧化應激損傷直接相關[1]。隨著對HIE發(fā)病機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)可降低氧化應激損傷[2]；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic protease-3，Caspase-3)、內(nèi)源性激活素A(endogenous activin A,ACT A)又在一定程度上與氧化應激的損傷程度具有相關性[3-4]，調(diào)控以上因素的表達水平或許對降低或抑制氧化應激損傷具有一定作用。目前，通過重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin, rhu-EPO)來增加成熟紅細胞數(shù)量，進而提高氧氣傳輸總量，改善腦組織缺血、缺氧癥狀已獲得初步共識[5]。但對rhu-EPO是否有利于降低氧化應激損傷的報道相對較少。本研究通過隨機對照實驗，探討rhu-EPO對HIE治療效果的同時，并對其是否調(diào)節(jié)氧化應激損傷的作用進行初步分析，現(xiàn)報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1 一般資料 選擇2013年2月—2015年5月在我院就診且符合納入標準的新生兒HIE 130例，按隨機數(shù)字表法分為A組65例，男性48例、女性17例，胎齡(39.6±1.4)周，出生體質(zhì)量(3 338±432) g，HIE分級中度39例，重度26例；B組65例，男性45例、女性20例，胎齡(39.8±1.3)周，出生體質(zhì)量(3 353±419) g，HIE分級中度40例、重度25例。并選擇同期正常自然分娩的健康新生兒65例為C組，男性46例、女性19例，胎齡(39.8±1.1)周，體質(zhì)量(3 353±429) g。3組性別構成、胎齡、出生體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，A組與B組HIE評估分級差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者家屬或監(jiān)護人知情并簽署知情同意書。

1.2 納入標準 ①病例符合HIE診斷標準[6]；②入院日齡<72 h；③體質(zhì)量≥2 500 g且胎齡≥37周。排除標準：①合并嚴重先天性異常；②存在頭部產(chǎn)傷或顱內(nèi)出血；③病例脫落者。

1.3 治療方法 2組均給予相同的常規(guī)治療，如給予常規(guī)神經(jīng)營養(yǎng)藥物及降顱壓藥物，維持正常血壓、動脈血氣及酸堿平衡等。在此基礎上，A組給予rhEPO(華北制藥集團有限責任公司，批號S20001304)輔助治療。首次皮下注射，后改為靜脈滴注。每次劑量300 U/kg，3次/周，以4周1個療程，連續(xù)治療3個療程。

1.4 評估標準

1.4.1 治療效果評價 在患兒治療1個療程后，由專業(yè)醫(yī)師對患兒神經(jīng)系統(tǒng)癥狀進行評估。顯效：患兒原始反射和肌張力等癥狀恢復正常，無抽搐癥狀；有效：患兒原始反射和肌張力等癥狀有所改善但未達到正常水平；無效：以上指標無改善或加重。治療有效率=(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.4.2 實驗室指標 A、B組以治療為起點，C組以出生為起點，分別采集3組在治療當天、治療1周及治療1個療程3個時間點的外周靜脈血5～7 mL，室溫30 min，離心3 000 r/min 10 min，緩慢吸取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測血清中Caspase-3及、內(nèi)源性激活素A(endogenous activin A,ACT A)的水平，試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平，采用硫代巴比妥法測定MDA水平，試劑盒購自南京建成生物工程所。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 新生兒神經(jīng)行為測定(neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)評分[7]3組新生兒出生后1、2、4周及療程結束時，由專業(yè)醫(yī)師對其進行NBNA評測。該評分總分40分，評分越高，提示新生兒越健康。

1.4.4 不良反應及預后 記錄A、B組在治療結束至隨訪1年中發(fā)生發(fā)育遲緩、腦癱、智障、癲癇及死亡情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。等級資料比較采用秩和檢驗；計量資料比較采用重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2組療效比較 治療1療程后，A組共60例(92.3%)治療有效，B組共46例(70.7%)治療有效，A組療效優(yōu)于B組(U=3.242，P=0.001)，見表1。

表1 2組治療效果比較Table 1 Comparison of treatment effect between two groups (n=65，例數(shù)，%)

2.2 3組SOD 、MDA、Caspase-3和ACT A比較 A組和B組SOD、ACT A均呈逐漸升高趨勢，而C組較平穩(wěn)；A組和B組MDA均呈逐漸降低趨勢，C組較平穩(wěn)；A組和B組Caspase-3呈先升高后降低的趨勢，C組較平穩(wěn)。3組上述指標在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別 SOD(kU/L)治療當天治療1周治療4周MDA(mmol/L)治療當天治療1周治療4周A組 59．9±13．595．8±12．9118．4±13．35．9±0．54．8±0．44．2±0．4B組 59．1±12．978．5±12．8106．6±12．96．0±0．65．4±0．64．3±0．3C組 123．3±12．6122．8±12．7124．3±12．33．8±0．43．8±0．33．9±0．3組間 F=9．924 P=0．027F=5．646 P=0．032時點間 F=8．115 P=0．033F=5．231 P=0．035組間·時點間F=7．247 P=0．048F=4．835 P=0．047組別 Caspase?3(μg/L)治療當天治療1周治療4周ACTA(μg/L)治療當天治療1周治療4周A組 5．83±0．747．69±0．893．63±0．684．32±0．444．45±0．454．56±0．47B組 5．92±0．889．66±0．966．24±0．924．53±0．465．55±0．546．83±0．63C組 2．81±0．642．92±0．622．86±0．632．75±0．322．84±0．352．81±0．32組間 F=12．394 P=0．021F=7．442 P=0．029時間點 F=9．042 P=0．033F=6．148 P=0．042組間·時點間F=5．396 P=0．038F=5．212 P=0．047

2.3 3組NBNA評分比較 治療當天A組和B組NBNA評分均較低，但治療后A組和B組的NBNA評分逐漸升高，特別是A組，到治療結束時與C組基本無差別，3組在組間、時點間以及組間組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

組別 NBNA評分(分)治療當天治療1周治療4周治療結束A組 29．8±1．835．9±2．336．6±2．438．1±1．9B組 29．4±1．832．7±2．133．1±2．234．3±1．8C組 38．8±0．938．7±1．238．9±1．138．9±1．1組間 F=7．342 P=0．035時間點 F=6．935 P=0．041組間·時點間F=6．342 P=0．045

2.4 不良反應 隨訪期間，A組共5例出現(xiàn)不良癥狀，其中癲癇2例、智障2例、腦癱1例；B組共20例出現(xiàn)不良癥狀，其中癲癇8例、智障8例、腦癱1例、發(fā)育遲緩3例。B組不良癥狀發(fā)生率高于A組(χ2=11.144，P=0.025)。

3 討 論

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是來源于腎臟的一種糖蛋白，具有較強的促前體紅細胞增殖與分化的作用。最初EPO廣泛應用于早產(chǎn)兒貧血防治及慢性腎性貧血中。但隨著EPO臨床應用的增多及對HIE致病機制的研究，越來越多的數(shù)據(jù)顯示，EPO不僅具有促進造血祖細胞增殖及分化的作用，還可對因缺血缺氧造成的大腦損傷起到一定保護作用。Juul 等[8]研究表明，EPO可以通過抑制神經(jīng)細胞凋亡、減輕炎癥反應、減少NO產(chǎn)生及誘導血管生成等途徑來保護神經(jīng)系統(tǒng)。但Juul的研究是以動物模型為研究對象，EPO的作用機制是否可以完全照搬到臨床應用，仍有待進一步確認。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HIE的發(fā)病機制除了缺血缺氧所導致的氧化應激損傷外[9]，還可能與神經(jīng)細胞凋亡、過激的炎癥反應、興奮性氨基酸毒性、自由基及NO大量產(chǎn)生具有相關性[10]。因此，與以上相關蛋白的研究也逐漸成為當下研究及治療HIE的熱點。了解HIE患兒以上蛋白表達變化情況，將有助于更深入及準確了解rhu-EPO的臨床作用效果。

作為體內(nèi)主要的氧自由基清除酶，SOD含量高低與人體氧自由基清除能力呈正相關性。研究證實，低氧會導致細胞內(nèi)氧自由基表達增加，而窒息則會導致機體處于低氧環(huán)境，進而導致體內(nèi)氧自由基水平升高，而高水平的氧自由基又是引發(fā)氧化應激損傷的重要物質(zhì)之一[11]。此外，氧化應激反應后隨之可發(fā)生細胞膜脂質(zhì)化過氧反應。而MDA即使脂質(zhì)化過氧反應的最終產(chǎn)物，換言之，氧化應激損傷越重，發(fā)生脂質(zhì)化過氧反應也越多，產(chǎn)生的MDA也隨之增加。本研究結果顯示，在治療前，A、B組SOD水平低于C組而MDA水平均高于C組，提示此時患兒體內(nèi)氧自由基水平較高，且已發(fā)生大量氧化應激損傷；而隨著治療的進行，A、B組SOD水平逐漸增高，而MDA水平則逐漸下降，在治療1個療程后，基本與健康組持平；在治療1周時，A組改善效果要優(yōu)于B組?？梢娊o予rhu-EPO對較快降低氧化應激的損傷水平具有一定幫助。

另外，關于Casapse-3與細胞凋亡的已有大量相關報道[12]。目前認為，Caspase-3不僅在凋亡途徑中發(fā)揮作用，而且還可被激活，誘發(fā)正常細胞凋亡。ACT A則是近年來較受關注的β超轉(zhuǎn)化生長因子家族中一種細胞因子。有研究顯示,當神經(jīng)系統(tǒng)受到損失時可反向調(diào)節(jié)ACT A高表達來保護神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及髓鞘的形成[4]，而這種作用在早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段尤為突出。此外，ACT A可促進炎癥細胞富集及促炎癥因子表達，故抑制ACT A表達對抗炎具有一定作用[13]。本研究結果顯示，治療當天A組和B組Caspase-3及ACT A血清水平均高于健康組，隨后A、B組Caspase-3均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，其中A組上升幅度小于B組，且較快恢復至正常水平；與此同時，B組ACT A水平較快升高，而A組ACT A水平則未明顯增加。推測：由于從細胞凋亡到細胞恢復正常需要一定周期，故在Caspase-3的表達水平變化上略顯滯后；而ACT A作為細胞釋放的細胞因子，一旦細胞狀態(tài)改善，可直接影響表達水平。但2組經(jīng)治療后，A組ACT A水平未明顯上升，而B組則逐漸呈現(xiàn)上升趨勢。這與rhu-EPO的作用機制可能存在一定相關性。正是由于rhu-EPO對內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)細胞的促恢復作用，從而反饋性下調(diào)了ACT A[14]。若僅依據(jù)A、B、C組SOD、MDA、Caspase-3、ACT A表達水平，A組治療效果可能優(yōu)于B組，而該推測與統(tǒng)計的治療效果完全符合。此外，通過不同時期NBNA評分結果也進一步證實了rhu-EPO對輔助治療HIE具有明顯促進作用。另外，在不良反應發(fā)生率比較中，A組發(fā)生率明顯少于B組。

綜上所述，rhu-EPO輔助治療HIE，有助于提高機體SOD水平，減少氧化應激損傷，并下調(diào)Caspase-3及ACTA水平，從而獲得較高療效。但本研究納入病例數(shù)較少，且隨訪時間偏短，若要獲得更為可信的結論，后續(xù)還需進行大樣本、長期隨訪的隨機對照試驗。

[1] Tataranno ML,Perrone S,Buonocore G. Plasma biomarkers of oxidative stress in neonatal brain injury[J]. Clin Perinatol,2015,42(3):529-539.

[2] 李玉飛,鹿玲. 過敏性紫癜患兒血漿髓過氧化物酶、丙二醛、超氧化物歧化酶及總抗氧化能力水平變化[J].臨床兒科雜志,2015,33(4):357-360.

[3] Hagar H,Al Malki W. Betaine supplementation protects against renal injury induced by cadmium intoxication in rats:role of oxidative stress and caspase-3[J]. Environ Toxicol Pharmacol,2014,37(2):803-811.

[4] Brackmann FA,Alzheimer C,Trollmann R. Activin A in perinatal brain injury[J]. Neuropediatrics,2015,46(2):82-87.

[5] 鐘洪飛.重組人促紅細胞生成素治療新生兒缺氧缺血性腦病臨床意義[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2014,8(24):4-5.

[6] 季麗華.早產(chǎn)兒缺氧缺血性腦病診斷標準探討[J].心血管病防治知識,2014，13(4):159-160.

[7] 史俊霞,曾國章.20項新生兒行為神經(jīng)測定應用研究[J].中國兒童保健雜志,2008,16(5):620.

[8] Juul SE,Pet GC. Erythropoietin and neonatal neuroprotection[J]. Clin Perinatol,2015,42(3):469-481.

[9] Chalak LF,Snchez PJ,Adams-Huet B,et al. Biomarkers for severity of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy and outcomes in newborns receiving hypothermia therapy[J]. J Pediatr,2014,164(3):468-474.

[10] 郭映輝,李貴霞,李文輝,等. 新生兒缺氧缺血性腦病血清白細胞介素 18 水平動態(tài)研究[J].河北醫(yī)科大學學報,2014,35(11):1337-1337.

[11] Tsang CK,Liu Y,Thomas J,et al. Superoxide dismutase 1 acts as a nuclear transcription factor to regulate oxidative stress resistance[J]. Nature Communications,2014,5(3):3446.

[12] 郭映輝，李梅，劉新光，等.動態(tài)監(jiān)測血清 caspase-3和NSE在新生兒缺氧缺血性腦病診治中的價值[J].河北醫(yī)科大學學報,2016,37(9):1069-1072.

[13] Zhao M,Zhu P,Fujino M,et al. Oxidative stress in hypoxic-ischemic encephalopathy:molecular mechanisms and therapeutic strategies[J]. Int J Mol Sci,2016,17(12):E2078.

[14] Liu F,McCullough LD. Inflammatory responses in hypoxic ischemic encephalopathy[J]. Acta Pharmacol Sin,2013,34(9):1121-1130.

Effectsofrhu-EPOadjuvanttherapyonoxidativestressinjuryandCaspase-3andACTAlevelsinneonateswithhypoxic-ischemicencephalopathy

SHI Jing-yi, XIA Li, ZHANG Heng, ZHU Shu-yao

(DepartmentofNeonatology,SichuanMaternalandChildHealthCareHospital,Chengdu610032,China)

ObjectiveTo investigate the effects of rhu-EPO on hypoxic-ischemic encephalopath(HIE) oxidative stress injury and Caspase-3，endogenous activin A(ACT A).MethodsOne hundred and thirty patients with HIE were randomly assigned to group A(rhu-EPO adjuvant therapy) and group B(conventional therapy), 65 patients in each group. And 65 cases of healthy newborns were choosen into the group C in order to compare the treatment effect, adverse rate of difference and the differences of superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde(MDA), Caspase-3, ACT A and neonatal behavioral neurological assessment(NBNA) observed on the day of treatment, 1 week of treatment and 4 weeks of treatment between group A and B.ResultsGroup A efficiency(92.3%) was higher than group B(70.7%), the difference was statistically significant(P<0.05); The levels of SOD, MDA, Caspase-3 and ACT A in group C were not significantly changed in the different time points, while the levels of SOD in group A and group B were significantly higher, there was significant difference in the inter-group, inter-point, and inter-group/hour-time interactions among the three groups(P<0.05). The levels of ACT A in group A and B were increased gradually, there was significant difference in the inter-group, inter-point, and inter-group/hour-time interactions between the three groups(P<0.05). The levels of Caspase-3 in group A and B were increased first and then decreased, there was significant difference in the inter-group, inter-point, and inter-group/hour-time interactions between the three groups(P<0.05). The level of MDA in group A and B were decreased gradually, in the inter-group, inter-point, and inter-group/hour-time interactions between the three groups(P<0.05). The NBNA scores of group A and B were gradually increased, there was significant difference in the inter-group, inter-point, and inter-group/hour-time interactions between the three groups(P<0.05). The incidence of adverse reactions in A group(7.7%) were lower than the B group(30.8%), the difference was statistically significant.ConclusionCapspase-3 and ACT A are involved in the pathophysiological process of HIE, and rhu-EPO is used to treat HIE, which is beneficial to reduce the oxidative stress injury and levels of Caspase-3 and ACT A.

hypoxia-ischemia, brain; recombinant human erythropoietin; infant, newborn

2017-03-21；

2017-04-05

石境懿(1982-)，女，四川成都人，四川省婦幼保健院主治醫(yī)師，醫(yī)學學士，從事新生兒常見疾病診治研究。

R743

A

1007-3205(2017)11-1295-05

(本文編輯：許卓文)