王文斌，喬子洋，劉 兵，王天陽，張文明，呂海濤*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤科，河北 石家莊 050051)

·論著·

TGF-β1、Slug及E-cadherin 在膽管癌組織中的表達(dá)及意義

王文斌1，喬子洋1，劉 兵2，王天陽1，張文明1，呂海濤1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤科，河北 石家莊 050051)

目的探討TGF-β1、Slug和E-cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)并分析其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測TGF-β1、slug和E-cadherin在70例膽管癌組織和20例癌旁組織中的表達(dá)情況，分析其臨床意義。結(jié)果70例膽管癌、20例膽管癌癌旁組織中TGF-β1、Slug和E-cadherin陽性表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TGF-β1和Slug陽性表達(dá)率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，在肝動(dòng)脈或門靜脈受侵者高于無受侵者(P<0.05)。E-cadherin陽性表達(dá)率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，在肝動(dòng)脈或門靜脈受侵者低于無受侵者(P<0.05)。膽管癌組織中，TGF-β1與Slug表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.658,P=0.000)；TGF-β1與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.527,P=0.000)；Slug與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.526,P=0.000)。結(jié)論TGF-β1、Slug及E-cadherin表達(dá)對膽管癌的發(fā)生發(fā)展可能發(fā)揮重要的作用。

膽管腫瘤;轉(zhuǎn)化生長因子β1；橋粒鈣黏蛋白質(zhì)類

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.007

膽管癌分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌，肝外膽管癌又分為肝門膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌，預(yù)后差，中位生存期只有24個(gè)月[1]。由于手術(shù)技術(shù)以及手術(shù)器械的進(jìn)步，手術(shù)切除率逐年提高，但是仍有許多患者由于門靜脈或肝動(dòng)脈受侵、受累肝葉硬化萎縮、肝功能受損等原因無法得到有效治療，急需尋找新的治療思路提高療效[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)[3]。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子Slug表達(dá)增強(qiáng)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF-β1)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的作用[4]。三者在膽管癌中共同表達(dá)的研究未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測并觀察TGF-β1、Slug和E-cadherin在膽管癌中的表達(dá)并探討其臨床意義。

1 資 料 與 方 法

1.1 標(biāo)本收集 收集2010年9月—2016年7月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的膽管癌標(biāo)本70例，男性27例，女性43例，年齡35～75歲，平均(60.0±8.5)歲；腫瘤直徑≥2 cm的57例，<2 cm的13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；組織學(xué)分級低分化20例，中分化18例，高分化32例；門靜脈或肝動(dòng)脈受侵21例。所有患者術(shù)前未經(jīng)放、化療。20例癌旁組織作為對照組。

1.2 試劑 兔抗人TGF-β1多克隆抗體為美國Genetex公司產(chǎn)品，兔抗人Slug、E-cadherin多克隆抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品，免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測方法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin perosidase,SP)法檢測標(biāo)本中TGF-β1、Slug和 E-cadherin蛋白的表達(dá)。組織蠟塊連續(xù)切片，厚度44 μm，65 ℃烘烤 24 h 備用。常規(guī)脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min。無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min。放入95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各3 min，80%乙醇3 min。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗10 min。3%雙氧水封閉，避光置于搖床20 min。蒸餾水洗5 min。 PBS沖洗5 min×3次。切片在枸櫞酸鈉溶液高壓鍋內(nèi)中火加熱，計(jì)時(shí)5 min。自然冷卻40～50 min。PBS 沖洗5 min×3次。滴加SP試劑盒A試劑，試劑滴加完成后37 ℃恒溫箱孵育20 min。去除A液，滴加一抗(TGF-β1 1∶200，Slug1∶200，E-cadherin 1∶200，均由PBS稀釋)，4 ℃冰箱過夜。放置30 min至室溫，PBS 沖洗5 min×3次。滴加SP試劑盒B試劑，37℃恒溫箱孵育20 min。PBS沖洗5 min×3次，滴加SP試劑盒C試劑，37℃恒溫箱20 min孵育。PBS沖洗5 min×3次。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色液顯色，顯色時(shí)間為TGF-β1 60 s、Slug 30 s、E-cadherin 30 s。蘇木精復(fù)染30 s。鹽酸酒精分化1 s。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。以結(jié)腸癌組織切片作為陽性對照，陰性對照以PBS替代一抗。

1.4 結(jié)果判定 TGF-β1表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒；Slug表達(dá)以胞核伴或不伴胞漿出現(xiàn)棕黃色染色顆粒；E-cadherin的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒。以陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色深淺兩方面綜合評分。按陽性區(qū)域染色強(qiáng)度評分：陰性為0分，淺染色為1分，中等染色為2分，強(qiáng)染色為3分，極強(qiáng)染色記為4分。光鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞百分比為：≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最終染色評分為兩項(xiàng)積分相加：7～8分為強(qiáng)陽性(+++)，4～6分為陽性(++)，2～3分為弱陽性(+)，0～1分為陰性(-)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析；生存率分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β1、Slug及E-cadherin在膽管癌組織中的表達(dá) TGF-β1表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色，在膽管癌組陽性表達(dá)47例(67.1%)，在癌旁組織陽性表達(dá)率為5例(25.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.325，P=0.001)(圖1)。Slug以胞核伴或不伴胞漿出現(xiàn)棕黃色染色即判定為陽性，Slug在膽管癌組陽性表達(dá)率為44例(62.9%)，在癌旁組織表達(dá)陽性率為6例(30.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.801，P=0.009)(圖2)。E-cadherin表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒，在膽管癌組陽性表達(dá)率為29例(41.4%)，在癌旁組織陽性表達(dá)率為16例(80.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.257，P=0.002)(圖3)。

圖1膽管癌組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×200)
Figure1ExpressionofTGF-β1incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×200)

圖2膽管癌組織中Slug蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×200)
Figure2ExpressionofSlugincholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×200)

圖3膽管癌組織中E-cadherin蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×200)
Figure3ExpressionofE-cadherinincholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×200)

2.2 不同臨床病理參數(shù)TGF-β1、Slug及E-cadherin蛋白的表達(dá) 不同年齡、不同腫瘤大小和腫瘤不同分化程度之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有肝動(dòng)脈或門靜脈受侵者TGF-β1陽性表達(dá)率、Slug陽性表達(dá)率高于無肝動(dòng)脈或門靜脈受侵者(P<0.05)；有肝動(dòng)脈或門靜脈受侵者E-cadherin陽性表達(dá)率低于無肝動(dòng)脈或門靜脈受侵者(P<0.05)。 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TGF-β1和Slug陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；E-cadherin陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。見表1。

表1 TGF-β1、Slug及E-cadherin表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between expression of TGF-β1，Slug and E-cadherin in cholangiocarcinoma and clinicalpathlogical factors

2.3 TGF-β1、Slug及E-cadherin表達(dá)相關(guān)性分析 70例膽管癌組織標(biāo)本中，TGF-β1與Slug共同陽性表達(dá)40例，共同陰性表達(dá)19例，二者在膽管癌組織標(biāo)本中表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.658,P=0.000)；70例膽管癌組織標(biāo)本中，TGF-β1與E-cadherin共同陽性表達(dá)28例，共同陰性表達(dá)22例，二者在膽管癌組織標(biāo)本中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.527,P=0.000)；70例膽管癌組織標(biāo)本中，Slug與E-cadherin共同陽性表達(dá)27例，共同陰性表達(dá)24例，二者在膽管癌組織標(biāo)本中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.526,P=0.000)。 見表2。

表2 TGF-β1、Slug及E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of E-cadherin，TGF-β1 and Slug expression (例數(shù))

3 討 論

膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。典型的上皮細(xì)胞為高度有序的單層細(xì)胞，形態(tài)均一，細(xì)胞間有規(guī)律地緊密黏附在一起。間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)各異，缺乏規(guī)律，細(xì)胞間黏附力小，有很強(qiáng)的遷移侵襲能力。近年大量研究表明EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[5]。EMT是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的病理生理過程，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性喪失及獲得間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，EMT最基本的條件是細(xì)胞形態(tài)、黏附力及遷移力的改變。以EMT發(fā)生的生物學(xué)環(huán)境分為3型，其中Ⅲ型指上皮源性腫瘤相關(guān)的表型轉(zhuǎn)化，具有5條調(diào)控通路，代表性分子改變主要包括：調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)如Twist、Snail、Slug、NF-kB等，vimentin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)EMT在膽管癌的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，有可能成為新的治療靶點(diǎn)[6]。EMT的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，涉及眾多的生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞通路。膽管癌的發(fā)生與原發(fā)性硬化性膽管炎、膽管結(jié)石、膽汁淤積等膽管慢性炎癥刺激有關(guān)，屬于炎癥性腫瘤范疇，其中TGF-β1升高非常明顯。

人類TGF-β1基因定位于染色體19q3，含有7個(gè)外顯子，其5′端序列含有5個(gè)調(diào)控區(qū)：1個(gè)類增強(qiáng)子活性區(qū)，2個(gè)負(fù)調(diào)控區(qū)和2個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，對細(xì)胞分化和免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，TGF-β1還具有促進(jìn)腫瘤血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫抑制的作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。TGF-β1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮雙重作用，腫瘤的起始階段，抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在腫瘤進(jìn)展期，通過多種信號通路誘導(dǎo)調(diào)控EMT，促進(jìn)新生血管形成，腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，TGF-β1被認(rèn)為是誘導(dǎo)EMT最重要的生長因子。研究表明TGF-β1異常表達(dá)可影響肝內(nèi)膽管癌的惡性生物學(xué)行為，是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)[7]；同時(shí)還可以促進(jìn)EMT的發(fā)生，影響膽管癌的發(fā)生發(fā)展[8]。

Snail超家族編碼鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子，一般由1個(gè)含有4～6個(gè)鋅指的高度保守的羥基和1個(gè)氨基末端組成，鋅指是C2H2型。Snail家族分為Snail和Slug亞家族。Slug位于染色體8q11.21，cDNA全長2.4 kb，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，是EMT過程的重要調(diào)控因子，其以鋅指與E-cadherin啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合后，作為轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，特異抑制黏附連接成分，減少細(xì)胞間黏附，促使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)，靶向沉默胰腺癌細(xì)胞MIAPaca-2中Slug的表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。而轉(zhuǎn)染DNAJC6的肝癌細(xì)胞HepG2 Slug基因表達(dá)明顯升高，E-cadherin和ZO-1基因表達(dá)顯著下降，誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生[9]。

E-cadherin是一種鈣依賴細(xì)胞間黏附分子，也稱為Uvomorulin、L-CAM或Cell-CAM120/80，基因定位于人類16號染色體的長臂上(16 q22,1)，長度為100 kb，含有16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子。E-cadherin蛋白包括3個(gè)區(qū)域：N端細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和C端細(xì)胞質(zhì)區(qū)。人體的各種上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均存在著E-cadherin蛋白，在保持細(xì)胞的極性和完整性等方面發(fā)揮重要作用。E-cadherin在各種上皮性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或消失[10]，并且與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。國內(nèi)學(xué)者采用小干擾RNA沉默胃癌細(xì)胞S100A2和E-cadherin基因后，細(xì)胞生長速度和細(xì)胞侵襲力均明顯增加，S100A2和E-cadherin蛋白證實(shí)具有抑制細(xì)胞增殖和侵襲的能力[11]。

目前，TGF-β1、Slug及E-cadherin在膽管癌中的共表達(dá)情況以及相關(guān)性研究未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1與Slug在膽管癌組織中的表達(dá)率較癌旁組織中的表達(dá)明顯升高[67.1%(47/70)vs25.0%(5/20)；62.9%(44/70)vs30.0%(6/20)]，而E-cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)率較癌旁組織中的表達(dá)明顯降低[41.4%(29/70)vs80.0%(20/16)]。說明TGF-β1、Slug及E-cadherin的異常表達(dá)可能促進(jìn)了膽管癌的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和Slug表達(dá)隨著膽管癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝動(dòng)脈或門靜脈受侵的發(fā)生而增強(qiáng)，E-cadherin表達(dá)隨著膽管癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝動(dòng)脈或門靜脈受侵的發(fā)生而降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)性分析表明TGF-β1與Slug存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，而TGF-β1、Slug與E-cadherin存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。說明TGF-β1可能促進(jìn)了膽管癌EMT的發(fā)生，并通過促進(jìn)Slug的表達(dá)抑制了E-cadherin的表達(dá)，導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞間黏附能力下降，癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶而黏附種植于遠(yuǎn)處器官，促進(jìn)了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移和血管侵犯。因此，TGF-β1、Slug及E-cadherin可作為判斷膽管癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，并且可能影響患者的預(yù)后。

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TheexpressionandclinicalsignificanceofTGF-β1、SlugandE-cadherinincholangiocarcinoma

WANG Wen-bin1, QIAO Zi-yang1, LIU Bing2, WANG Tian-yang1, ZHANG Wen-ming1, LV Hai-tao1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China; 2.DepartmentofOncology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the expression of TGF-β1, Slug and E-cadherin in cholangiocarcinoma tissues and their clinical significance.MethodsImmunohistochemical SP method was used to detect the expression of TGF-β1, Slug and E-cadherin in 70 cases of cholangiocarcinoma and 20 cases of para-tumor tissue. The clinical significance were analyzed. The correlation between expression of TGF-β1, Slug and E-cadherin was analyzed by Spearman analysis method.ResultsThe positive expression rates of TGF-β1, Slug and E-cadherin in cholangiocarcinoma tissue were significantly different from those in para-tumor tissue(P<0.05). The positive expression rates of TGF-β1 and Slug were significantly higher in lymph node metastasis and hepatic artery or portal vein invasion patients than those in no lymph node metastasis(P<0.05)and hepatic artery or portal vein invasion patients(P<0.05). The positive expression rates of E-cadherin were significantly lower in lymph node metastasis and hepatic artery or portal vein invasion patients than those in no lymph node metastasis(P<0.05)and hepatic artery or portal vein invasion patients(P<0.05). There was a positive correlation between TGF-β1 and Slug expression in cholangiocarcinoma(rs=0.658,P=0.000). There were negative correlations between TGF-β1 and E-cadherin(rs=-0.527,P=0.000). The expression of Slug was negatively correlated with the expression of E-cadherin(rs=-0.526,P=0.000).ConclusionThe abnormal expressions of TGF-β1, Slug and E-cadherin may play an important role in carcinogenesis and progression of cholangiocarcinoma.

bile duct neoplasms； transforming growth factor beta 1; desmosomal cadherins

2017-07-10；

2017-09-27

王文斌(1973-)，男，河北保定人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事肝膽胰脾疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:wwb2981@163.com

R735.8

A

1007-3205(2017)11-1271-05

(本文編輯：許卓文)