沈?qū)W懷++張丹俊++潘孝成++趙瑞宏++戴銀++胡曉苗

摘要 規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）是一類存在于古細(xì)菌和細(xì)菌基因組內(nèi)的特殊結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)沙門菌中存在2個(gè)CRISPR位點(diǎn)，該結(jié)構(gòu)不僅參與沙門氏菌對(duì)質(zhì)粒和噬菌體等外源DNA的獲得性免疫，同時(shí)其序列結(jié)構(gòu)的高度可變性，可作目標(biāo)基因用以沙門氏菌的基因分型和進(jìn)化研究。本文綜述了沙門氏菌基因組中CRISPR位點(diǎn)的基本結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和功能及其在沙門氏菌基因分型和進(jìn)化研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 沙門氏菌；規(guī)律成簇的間隔的短回文重復(fù)序列；功能；分型；進(jìn)化

中圖分類號(hào) R155.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）20-0236-02

Reasearch Advance on Structure，F(xiàn)unction and Application of CRISPR in Salmonella

SHEN Xue-huai ZHANG Dan-jun PAN Xiao-cheng ZHAO Rui-hong DAI Yin HU Xiao-miao

（Institute of Animal and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei Anhui 230031）

Abstract Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRSIPR）are widespread in the genomes of many bacteria and almost archaea.There are two CRSIPR loci located in Salmonella genome，which provide acquired immunity against foreign DNA from plasmid and bacteriophage.Besides，it is suitable as a target gene for genotyping and evolutionary studies of Salmonella due to the multiple structures.In this review，the basic structure，mechanisms and functions of CRSIPR of Salmonella as well as the research progress of CRISPR on bacteria typing and evolution were introduced.

Key words Salmonella；CRSIPR；function；typing；evolution

沙門氏菌（Salmonella）為革蘭氏陰性、兼性厭氧、無(wú)芽孢的小桿菌，目前發(fā)現(xiàn)的有2 600多種血清型，其中絕大部分血清型對(duì)動(dòng)物和人類具有致病性，可通過(guò)污染食物引起人類中毒，是重要的人畜共患病原菌[1]。全球每年大約有13億人因沙門氏菌感染出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀[2]，給人類衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。

CRISPR位點(diǎn)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌針對(duì)噬菌體等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng)[4-5]，該結(jié)構(gòu)存在絕大多數(shù)古細(xì)菌和約40%的細(xì)菌的基因組中[6]，研究表明CRISPR位點(diǎn)序列的變化可以使細(xì)菌獲得對(duì)噬菌體等外源DNA的免疫，并且在細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中其結(jié)構(gòu)的高度可變性，可以作為細(xì)菌分型與進(jìn)化研究的理想位點(diǎn)[4-6]。沙門氏菌基因組存在2個(gè)CRISPR位點(diǎn)，近年來(lái)關(guān)于沙門氏菌CRISPR位點(diǎn)在細(xì)菌分型、菌株溯源和細(xì)菌進(jìn)化等方面的研究也越來(lái)越受到關(guān)注。

1 沙門氏菌CRISPR 位點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

根據(jù)CRISPR 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//crispr.u-psud.fr/）中的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌基因組存在 2 個(gè)CRISPR 位點(diǎn)，由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）3個(gè)部分組成[7]。前導(dǎo)序列位于CRISPR 位點(diǎn)的5′端，大小300～500 bp，富含AT堿基的序列，序列結(jié)構(gòu)保守，與第1個(gè)重復(fù)序列相連。新序列的插入總發(fā)生在前導(dǎo)序列和相鄰的基序之間，因而前導(dǎo)序列很可能起著CAS相關(guān)蛋白（CRISPR-associated）識(shí)別位點(diǎn)的作用，并可能作為CRISPR位點(diǎn)的啟動(dòng)子[4]。重復(fù)區(qū)序列在CRIPSR位點(diǎn)中相對(duì)保守，大小為24～47 bp，在3′末端存在GAAA（C/G）的保守序列，聚類分析顯示，一些進(jìn)化關(guān)系很遠(yuǎn)的原核生物具有相同或相似的重復(fù)序列，說(shuō)明在原核生物間存在CRISPR 的水平轉(zhuǎn)移[7]。重復(fù)序列能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其數(shù)量與CAS系統(tǒng)的完整程度呈正相關(guān)，因而該結(jié)構(gòu)可能是作為CAS蛋白識(shí)別標(biāo)記[8]。間隔區(qū)序列與同一位點(diǎn)的重復(fù)序列大小相近。最早認(rèn)為，間隔區(qū)序列是細(xì)菌等特有的一種結(jié)構(gòu)序列[4]，其后的研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)序列可能自于外源DNA序列（噬菌體或質(zhì)粒）的插入。Barrangou等用2種噬菌體感染嗜熱鏈球菌，發(fā)現(xiàn)在耐噬菌體的嗜熱鏈球菌的CRISPR結(jié)構(gòu)中，臨近前導(dǎo)序列末端出現(xiàn)了新的repeat-spacer序列，并且如果新的插入序列與噬菌體的某段基因序列相同，該細(xì)菌就表現(xiàn)出對(duì)噬菌體的耐受，而一旦序列改變又會(huì)重新敏感[9]。因此，間隔區(qū)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌對(duì)噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA的免疫有關(guān)。

2 作用機(jī)制與功能

2.1 作用機(jī)制

細(xì)菌CRISPR位點(diǎn)類似于其他生物的免疫系統(tǒng)。當(dāng)噬菌體或質(zhì)粒等侵入細(xì)菌，CRISPR系統(tǒng)會(huì)將與入侵外源DNA的同源片段插入前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間，同時(shí)復(fù)制一個(gè)新的重復(fù)區(qū)，形成新的repeat-spacer單元，以插入后的CRISPR轉(zhuǎn)錄RNA，經(jīng)加工后與Cas相關(guān)蛋白結(jié)合，形成Cas/crRNA蛋白復(fù)合體，并以crRNA為向?qū)蛄姓业酵庠春怂岚行蛄?，進(jìn)行降解[10]。endprint

2.2 功能

沙門氏菌通過(guò)在CRISPR位點(diǎn)插入與外源質(zhì)粒和噬菌體等相同基因序列的間隔區(qū)來(lái)抵御入侵。隨著環(huán)境中噬菌體和質(zhì)粒等不斷進(jìn)化，會(huì)不斷有新的外源基因序列插入CRISPR位點(diǎn)，這些新插入的間隔區(qū)序列包含細(xì)菌所特有的生態(tài)學(xué)和地理學(xué)信息[11]。因而，CRISPR可以看作是沙門氏菌進(jìn)化記錄器，根據(jù)CRISPR位點(diǎn)間區(qū)序列排列的差異，能夠判斷不同菌株間的進(jìn)化關(guān)系，并且研究發(fā)現(xiàn)沙門菌的CRI-SPR與血清型密切相關(guān)，使得人們能夠?qū)ι抽T氏菌進(jìn)行快速溯源[12]。

3 應(yīng)用研究

3.1 在細(xì)菌基因分型中的應(yīng)用

隨著細(xì)菌的進(jìn)化，在CRISPR位點(diǎn)中不斷有新的間隔序列插入和舊序列的丟失，是細(xì)菌基因組中進(jìn)化速度最快的基因元件之一，因而其具有很高的多態(tài)性，這種多態(tài)性包含細(xì)菌所特有的生物學(xué)和地理學(xué)特征。通過(guò)對(duì)CRISPR位點(diǎn)的擴(kuò)增和測(cè)序，利用在線工具CRISPR finder（http：//crispr.u-psud.fr/Server/）比對(duì)分析間隔序列的組成和排列從而對(duì)細(xì)菌分型[13]。Fabre等[14]對(duì)包括130種血清型的783株沙門氏菌進(jìn)行CRISPRS分型分析，研究發(fā)現(xiàn)CRISPRS分型具有很高的分辨能力，根據(jù)CRISPRS位點(diǎn)的大小就能初步對(duì)沙門菌進(jìn)行分型。還可以用分析軟件對(duì)CRISPRS位點(diǎn)的間隔序列進(jìn)一步分析，得到更細(xì)致的分型結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果不僅可以把不同血清型菌株區(qū)分開，即使對(duì)高同源性的腸炎沙門氏菌也具有一定的區(qū)分能力，除此之外，其具有耗時(shí)更短、自動(dòng)化程度更高等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效區(qū)分暴發(fā)流行血清型的菌株，是一種較理想的沙門氏菌分型方法[15]。

3.2 基于CRISPR位點(diǎn)發(fā)展的其他細(xì)菌基因分型方法

不僅可以單獨(dú)利用CRISPR對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型，還可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行方法發(fā)展和改良，使之具有更好的分辨率和可操作性。Liu等[16]將多毒力基因位點(diǎn)序列分型（MVLST）分型方案與CRISPR分型相結(jié)合，形成CRISPR-MVLST分型方法。其將fimH和sseL這2個(gè)毒力基因與 CRISPR位點(diǎn)組合，將fimH、sseL、CRISPR1、CRISPR2等4個(gè)等位基因組合，形成一個(gè)特定等位基因型圖譜，作為唯一指定的序列類型（ST）。研究者利用該方法對(duì)9種血清型的171株沙門氏菌進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)該分型效果菌均優(yōu)于CRISPR分型和多位點(diǎn)序列分型（MLST），可作為沙門菌暴發(fā)流行時(shí)一種重要的分型方法。Shariat等[17]比較了脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和CRISPR-MVLST 2種方法對(duì)84株紐波特沙門氏菌分型的效果，發(fā)現(xiàn)二者辛普森指數(shù)D值均高于0.95，在實(shí)用中可互為補(bǔ)充。Li等[18]選取CRISPR1與CRISPR2靠近5′端的第1個(gè)間隔序列結(jié)合在一起作為菌株分型的總序列對(duì)沙門氏菌進(jìn)行分型。利用該方法對(duì)21種血清型的82株沙門氏菌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，雖然該方法弱于傳統(tǒng)的CRISPR與PFGE分型，但優(yōu)于MLST分型，并且不需要對(duì)CRISPR全序列圖譜進(jìn)行分析，成本低，操作簡(jiǎn)單，實(shí)用性更強(qiáng)。

3.3 在細(xì)菌進(jìn)化分析中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，插入間隔序列可讓細(xì)菌獲得抵抗外源DNA入侵的免疫能力，丟失的間隔序列可能是在當(dāng)前環(huán)境中對(duì)細(xì)菌的生存價(jià)值不大，或者是為了避免CRISPR位點(diǎn)太長(zhǎng)而產(chǎn)生的一種機(jī)制，新舊間隔序列的插入和丟失同時(shí)發(fā)生，而且新序列的插入總是位于前導(dǎo)序列和其臨近的重復(fù)序列之間，而丟失的序列通常位于CRISPR位點(diǎn)3′端的尾隨序列。因此，CRISPR位點(diǎn)間隔序列的變化記錄著細(xì)菌的進(jìn)化歷程，并且反映不同菌株之間的親緣關(guān)系[19]。Timme等[20]對(duì)156株沙門氏菌基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)所反映的進(jìn)化模式與系統(tǒng)進(jìn)化不同，并且基因的水平轉(zhuǎn)移和共享環(huán)境的變化能夠?qū)ι抽T氏菌的分布產(chǎn)生影響。Fricke等[13]對(duì)21種血清型的28株沙門氏菌CRISPR位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移不僅能控制細(xì)菌短期的表型變化，也介導(dǎo)長(zhǎng)期亞型的進(jìn)化。

4 結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌CRISPR位點(diǎn)多態(tài)性不僅反映了細(xì)菌與所處環(huán)境的相互關(guān)系，同樣記錄了細(xì)菌的進(jìn)化歷程，因而CRISPR位點(diǎn)為沙門氏菌細(xì)菌的分型和進(jìn)化分析研究提供了一個(gè)適用的目標(biāo)基因，在細(xì)菌的監(jiān)測(cè)、溯源以及流行病學(xué)研究等方面具有重要意義，但是目前利用CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌分型的研究數(shù)據(jù)仍然有限，缺少相應(yīng)的細(xì)菌分型數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)CRI-SPR位點(diǎn)功能的研究也多集中在它的防御機(jī)制，其是否能像真核細(xì)胞中RNAi一樣用于基因沉默，是否參與細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生等方面值得進(jìn)一步研究。鑒于CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和特殊的功能，隨著研究的深入，相信會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。

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