楊小體，湯曉艷,*，張小慶，沈習(xí)習(xí)

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞血漿中頭孢噻肟及其主要代謝物

楊小體1,2，湯曉艷1,2,*，張小慶2，沈習(xí)習(xí)1,2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

研究頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）在雞血漿中代謝規(guī)律，建立同時檢測血漿中CTX及其主要代謝物去乙酰頭孢噻肟（desacetylcefotaxime，DCTX）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，以10 mg/kg的體質(zhì)量劑量給藥實驗蛋雞，并對給藥后不同時間點采集的血液樣品，進行CTX及其主要代謝物DCTX含量的檢測。結(jié)果表明，所建方法中CTX和DCTX的檢出限分別為0.07、0.14 μg/L；定量限分別為0.23、0.99 μg/L?；厥章史謩e為86.7%～95.2%、89.5%～112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于7.7%，滿足殘留分析方法的要求；CTX在蛋雞體內(nèi)分布迅速，給藥后即刻達到峰值（56.34 mg/L），且代謝較快，給藥24 h后檢測值低于3.0 μg/L，而主要代謝物DCTX在給藥45 m in后達到峰值（10.22 mg/L），消除相對緩慢，給藥24 h時檢測值仍可達到54.0 μg/L。

頭孢噻肟（CTX）；去乙酰頭孢噻肟（DCTX）；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）；血漿

頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）屬于人用β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有廣譜、高效、耐酶等特點。我國農(nóng)業(yè)部第560號公告明確禁止該藥用于畜禽養(yǎng)殖中[1]，但由于其對流感桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、淋球菌等[2-4]療效顯著，近年來發(fā)現(xiàn)CTX原藥或其生產(chǎn)下腳料被違規(guī)用于家禽養(yǎng)殖中的現(xiàn)象非常嚴(yán)重?？股氐倪`規(guī)違禁使用不僅會造成畜禽組織及其制品中的藥物殘留問題，威脅食品安全，而且會破壞生態(tài)環(huán)境平衡，促進細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，影響人類疾病的預(yù)防與治療[5]。

CTX在人體內(nèi)藥物代謝研究比較深入[6-7]，在犬、鼠、羊、兔等動物體內(nèi)也有相關(guān)研究[8-12]，但是，目前鮮見該藥在家禽體內(nèi)的相關(guān)研究報道。CTX在機體內(nèi)易代謝轉(zhuǎn)化，主要活性代謝物為去乙酰頭孢噻肟（desacetylcefotaxime，DCTX）。CTX及DCTX分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。目前CTX的殘留檢測方法基本只針對其原藥，關(guān)于其代謝物的檢測，僅有針對人、鼠血漿及腦脊液建立的高效液相色譜法報道[7,13-15]，且方法靈敏度較低，檢出限遠(yuǎn)不能滿足生物樣本微量殘留檢測的需要。因此，本實驗建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometriy，UPLC-MS/MS）同時檢測CTX及其主要代謝物的高靈敏度方法，并利用該方法對CTX在蛋雞血漿中的代謝殘留規(guī)律進行初步研究，為CTX在蛋雞組織中的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支撐和理論參考。

圖1 CTX（A）和DCTX（B）分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 M olecular structures of cefotaxime and desacetylcefotaxime

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康海蘭褐蛋雞6 只，210 日齡，體質(zhì)量1.5～2 kg，購自河北燕郊某養(yǎng)殖場。

CTX鈉標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%；CAS：66485-93-4）上海源葉生物科技有限公司；DCTX標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%；CAS：66340-28-1） 加拿大TRC公司；乙腈（HPLC級） 美國J.T.Baker公司；甲醇（HPLC級） 德國Merck公司；甲酸（HPLC級） 美國M reda Tecnology公司；實驗用水為M illi-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC儀 美國Waters公司；TRIPLE QUADTM3500液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司；XS105十萬分之一分析天平瑞士Mettler Toledo公司；D2012 plus臺式高速小型微量離心機 美國Scilogex公司；VORTEX-5渦旋振蕩器海門市其林貝爾有限公司；超聲波清洗機 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；M illi-Q超純水器 美國M illipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取CTX鈉和DCTX標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇-水（1∶1，V/V）為溶劑配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于棕色容量瓶中低溫避光保存（5 d以內(nèi)），測定當(dāng)天以甲醇-水梯度稀釋，配成一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：A g ilen t E c lip se P lu s C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相：A相為0.2%甲酸溶液，B相為乙腈；柱平衡時間1 m in；梯度洗脫程序：0～1.0 m in，95% A；1.0～3.0 m in，95%～60% A；3.0～5.0 m in，60% A；5.0～7.0 m in，95% A；流速0.3 m L/m in；進樣體積5 μL；外標(biāo)法定量。

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子掃描，多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），氣簾氣壓力35 MPa；霧化氣壓力55 MPa；干燥氣壓力55 MPa；撞氣壓力8 MPa；離子源電壓5 500 V；離子化溫度550 ℃；MRM定量離子對、去簇電壓及碰撞電壓見表1。

表1 CTX及DCTX質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimum parameters and selected fragment ions for cefotaxime and deacetylcefotaxime

1.3.3 蛋雞給藥與血液樣品采樣

健康海蘭褐蛋雞6 只，以全價飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，稱質(zhì)量后編號。給藥前禁食12 h，自由飲水，以10 m g/kg的體質(zhì)量劑量由一側(cè)翼下靜脈給藥，準(zhǔn)確記錄給藥時間。實驗蛋雞分別于給藥后5、10、15、30、45 m in，1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h等時間點由另一側(cè)翼下靜脈采血0.6～0.8 m L，血樣取出后立即移入含肝素鈉的離心管，3 500 r/m in離心6 m in，分離血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血漿樣品前處理

取血漿樣品100 μL，加入400 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋30 s，超聲10 m in提取，12 000 r/m in離心5 m in，取上清液過0.22 μm濾膜，UPLC-MS/MS方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿樣品前處理條件優(yōu)化

本實驗采用固相萃取法和有機溶劑沉淀法對前處理進行優(yōu)化，實驗發(fā)現(xiàn)用Oasis HLB等小柱凈化后的CTX回收率僅有30%～40%，原因可能是CTX極性較大，在固相萃取小柱上保留性差所致[16]。有研究表明，4 倍體積的甲醇或3 倍體積的乙腈可完全沉淀生物樣品中的蛋白質(zhì)[17]。本實驗比較了甲醇和乙腈沉淀蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)用甲醇沉淀的血漿蛋白更易離心分離，且不會吸附目標(biāo)物，目標(biāo)物回收率大于75%。實驗同時考察了血漿和甲醇不同比例（2∶5、1∶4、1∶5）時的沉淀效果，結(jié)果表明4 倍體積的甲醇可完全沉淀血漿蛋白，通過進一步優(yōu)化實驗條件，CTX和DCTX回收率均大于86.7%。目前，關(guān)于血漿前處理的研究中也多采用此方法[18-19]。此外，由于CTX在蛋雞體內(nèi)吸收迅速，血漿中藥物質(zhì)量濃度一般較高，不需氮吹濃縮的步驟，樣品前處理簡單快速、回收率高。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 色譜條件選擇與優(yōu)化

由于頭孢類抗生素在結(jié)構(gòu)上都含有羧酸基團，故早期采用離子交換色譜（一般選用陰離子交換柱）來測定這類藥物，但因所用的pH值往往低于其穩(wěn)定的最佳pH值而不甚理想。近年來大都改用反向色譜法，最常用的分析柱填料為ODS C18，但對于CTX這種強極性的β-內(nèi)酰胺類分離效果不好。因此實驗選用Agilent ZORBAX SB-Aq（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，ZorbaxXDB-C18（2.1 mm×150 mm，3 μm）色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱3 種對強極性化合物保留效果較好的色譜柱對分離效果進行了對比，結(jié)果表明Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）可將CTX和DCTX較好地分離，二者出峰時間分別為3.14 m in和2.68 m in，且峰形好、響應(yīng)值高、重復(fù)性好。

頭孢類抗生素常用的流動相為水、甲酸溶液、乙酸銨溶液與乙腈、甲醇[20-22]。本實驗對流動相進行了考察，水相分別以純水、甲酸溶液、乙酸銨溶液，有機相分別以乙腈、甲酸-乙腈、甲醇作為流動相在同一色譜條件下對目標(biāo)物進行梯度洗脫分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲酸溶液為流動相時，DCTX峰面積的響應(yīng)值比純水或乙酸銨溶液作為流動相時高10%左右，實驗通過對甲酸溶液進一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以0.2%甲酸溶液和乙腈作流動相時，CTX及DCTX的響應(yīng)值和峰形均優(yōu)于上述其他流動相，色譜圖如圖2所示。因此，選用0.2%甲酸溶液和乙腈作為本方法的流動相。

圖2 CTX和DCTX標(biāo)準(zhǔn)溶液典型色譜圖Fig. 2 Typical chromatograms of cefotaxime and desacetylcefotaxime in standard solution

2.2.2 質(zhì)譜條件選擇與優(yōu)化

圖3 CTX標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下的二級質(zhì)譜圖Fig. 3 MS2 spectrum of cefotaxime standard solution under positive ion mode

圖4 DCTX標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下的二級質(zhì)譜圖Fig. 4 MS2 spectrum of desacetylcefotaximestandard solution under positive ion mode

在正負(fù)離子模式下，分別進行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式和母離子。結(jié)果表明，CTX和DCTX均在離子源ESI+電離方式下獲得較高豐度的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，分別為m/z 456.1和m/z 414.1，再對分子離子采用子離子掃描方式進行二級質(zhì)譜分析，并對子離子進行優(yōu)化選擇，確定定量離子和輔助定性離子。得到CTX的特征離子峰為m/z 396.1、m/z 324.1，即[M+H-CH3COOH]+和[M+H-CH3COOH-CO-CO2]+[23]，與文獻報道一致[24-26]，DCTX的特征離子峰為m/z 241和m/z 285；其中m/z 241為β-內(nèi)酰胺環(huán)主要裂解碎片，且豐度最高；m/z 285為β-內(nèi)酰胺環(huán)較為特殊的開環(huán)方式[27]。CTX和DCTX的二級質(zhì)譜圖分別如圖3和圖4所示。

2.3 方法的線性范圍、檢出限和定量限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對血漿中CTX及其主要代謝物進行分析。準(zhǔn)確將一定量的CTX鈉和DCTX混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入按1.2.4節(jié)方法前處理過的空白血漿中，使二者最終上機質(zhì)量濃度范圍為2～1 000 μg/L。以化合物定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進行線性回歸計算。在優(yōu)化實驗條件下，分別以信噪比不小于3及10確定方法的檢出限和定量限。結(jié)果如表2所示。CTX和DCTX在2～1 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；檢出限和定量限均滿足殘留分析要求。

表2 方法線性范圍、檢出限及定量限Table 2 Linear ranges, lim its of detection and lim its of quantification for cefotaxime and desacetylcefotaxime

2.4 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白血漿中分別添加低、中、高3 個水平的CTX鈉和DCTX混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每添加實驗設(shè)6 個平行，按1.2.4節(jié)進行處理，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，48 h內(nèi)進樣2 次，計算其回收率及批內(nèi)、批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表3所示，CTX和DCTX的加標(biāo)回收率分別為86.7%～95.2%、89.5%～112%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于7.7%，滿足生物樣品定量分析要求。

表3 雞血漿中CTX和DCTX的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of cefotaxime sodium and desacetylcefotaxime from spiked chicken p lasma sam p les (n= 6)

2.5 CTX和DCTX在血漿中的殘留消除規(guī)律

用上述方法對血漿樣品進行前處理并上機檢測，外標(biāo)法定量。如圖5和圖6所示，所有樣品均檢測到CTX和DCTX，質(zhì)量濃度范圍為3～56 342 μg/L，隨著停藥時間的延長，兩者殘留量都有明顯下降趨勢。

圖5 雞血漿中頭孢噻肟殘留質(zhì)量濃度-時間曲線（n=6）Fig. 5 Concentration-time curve for cefotaxime in chicken plasma (n = 6)

由圖5可以看出，CTX在給藥后即刻達到峰值56 342 μg/L，隨后呈明顯下降趨勢，1.5 h后質(zhì)量濃度下降至946 μg/L，此后下降趨勢平緩，24 h時已降至3.0 μg/L，說明CTX在雞血漿中代謝消除迅速，與該藥在其他動物體內(nèi)研究結(jié)果一致[28-29]。

圖6 血漿中DCTX殘留質(zhì)量濃度-時間曲線（n=6）Fig. 6 Concentration-time curve for desacetylcefotaxime in chicken p lasma (n = 6)

由圖6可知，代謝物DCTX生成迅速，給藥5 m in后質(zhì)量濃度即可達到4 887 μg/L，由于CTX的代謝轉(zhuǎn)化，質(zhì)量濃度不斷升高，并于給藥45 m in后達到最高值10 215 μg/L，此后下降迅速。DCTX質(zhì)量濃度于給藥45 m in超過CTX，給藥24 h后DCTX質(zhì)量濃度仍為54.0 μg/L，說明DCTX消除相對緩慢，可延長CTX有效抗菌作用時間，這與文獻報道一致[15,30]。據(jù)報道，CTX對雞巴氏桿菌，雞白痢沙門氏菌和雞大腸桿菌等有較強的抗菌活性，最低抑菌質(zhì)量濃度為0.012 5～0.1 μg/L[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CTX在給藥24 h后檢測質(zhì)量濃度為3.0 μg/L，仍可達到有效抑菌質(zhì)量濃度。

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測CTX及其主要代謝物DCTX的方法，該方法樣品前處理簡便快速，回收率高，定量限及精密度均能滿足分析要求。應(yīng)用本方法對CTX及其主要代謝物在蛋雞血液中的殘

留消除規(guī)律進行初步探究，結(jié)果表明CTX在蛋雞體內(nèi)代謝消除較快，而其代謝物DCTX消除相對緩慢，且殘留量高，可作為殘留監(jiān)測的靶標(biāo)物，本研究解決了該藥在動物體內(nèi)由于代謝轉(zhuǎn)化而難于監(jiān)測的問題，為CTX在畜禽養(yǎng)殖中違禁使用的監(jiān)管監(jiān)測提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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Simultaneous Determ ination of Cefotaxime and Its Main Metabolite in Chicken Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YANG Xiaoti1,2, TANG Xiaoyan1,2,*, ZHANG Xiaoqing2, SHEN Xixi1,2
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, M inistry of Education, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Agri-Food Safety and Quality, M inistry of Agriculture,Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In order to study the pattern of cefotaxime metabolism in chicken plasma, an ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was successfully developed for the simultaneous determ ination of cefotaxime and its metabolite desacetylcefotaxime. Cefotaxime at a dose of 10 mg/kg was adm inistered to laying hen, and chicken plasma was collected at diff erent time points to quantitate cefotaxime and desacetylcefotaxime by UPLC-MS/MS. The results showed that the lim its of detection (LOD) for cefotaxime and desacetylcefotaxime were 0.07 and 0.14 μg/L, respectively; the lim its of quantification (LOQ) were 0.23 and 0.99 μg/L, respectively. The recoveries of cefotaxime and desacetylcefotaxime ranged from 86.7%–95.2% and 89.5%–112%, respectively, w ith relative standard deviation (RSD) less than 7.7%, which met the requirements for quantitative analysis. Cefotaxime was rapidly distributed in laying hens and reached the peak (56.34 mg/L) immediately after adm inistration, and the rate of cefotaxime metabolism was fast, which was detected at a level lower than 3.0 μg/L after 24 hours. The main metabolite deacetylcefetaxime reached its peak (10.22 mg/L) after 45 m in, and it was elim inated at a relatively slow rate was and was still as high as 54.0 μg/L at 24 h after adm inistration.

cefotaxime (CTX); desacetylcefotaxime (DCTX); ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); plasmaYANG Xiaoti, TANG Xiaoyan, ZHANG Xiaoqing, et al. Simultaneous determination of cefotaxime and its main metabolite in chicken plasma by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(22):317-321. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722047. http://www.spkx.net.cn

10.7506/spkx1002-6630-201722047

TS201.6

A

1002-6630（2017）22-0317-05

楊小體, 湯曉艷, 張小慶, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞血漿中頭孢噻肟及其主要代謝物[J]. 食品科學(xué), 2017,38(22): 317-321. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722047. http://www.spkx.net.cn

2017-04-08

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目

楊小體（1989—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：780525783@qq.com*通信作者：湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：txycaas@126.com