陳文彬，嚴(yán)文靜，徐幸蓮，章建浩*

（國(guó)家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095）

α-生育酚殼聚糖納米粒的制備、表征及體外緩釋抗氧化性能

陳文彬，嚴(yán)文靜，徐幸蓮，章建浩*

（國(guó)家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095）

α-生育酚作為天然抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，但由于其對(duì)氧氣、光照、金屬離子等環(huán)境敏感，易快速失活，且不溶于水，極大地限制了其應(yīng)用范圍。本研究采用乳化-離子凝膠兩步法制備α-生育酚殼聚糖納米粒，將α-生育酚進(jìn)行包埋。以顆粒平均粒徑、多分散系數(shù)、表面電位為參考指標(biāo)，通過單因素及正交試驗(yàn)考察殼聚糖（chitosan，CS）質(zhì)量濃度、α-生育酚質(zhì)量濃度、CS與三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）質(zhì)量比、pH值、攪拌速率等因素對(duì)納米顆粒平均粒徑和包封率的影響，確定最優(yōu)制備工藝。采用動(dòng)態(tài)光散射儀、掃描電鏡、傅里葉紅外光譜對(duì)納米顆粒進(jìn)一步表征，并考察其體外釋放性能和抗氧化效果，以期為α-生育酚在腌臘肉制品后期貯藏過中的脂質(zhì)抗氧化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，α-生育酚殼聚糖納米粒最優(yōu)制備工藝條件為CS質(zhì)量濃度1 mg/m L、α-生育酚質(zhì)量濃度1 mg/m L、CS與TPP質(zhì)量比7∶1、CS初始pH值為4.5、攪拌速率900 r/m in。所得納米顆粒平均粒徑214 nm，包封率51.65%。紅外光譜表明CS與三聚磷酸鈉靜電吸附，生育酚被包封。掃描電鏡下形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)大小均勻，呈規(guī)則球形。體外釋放實(shí)驗(yàn)和抗氧化實(shí)驗(yàn)表明α-生育酚殼聚糖納米粒具有緩釋抗氧化作用。

α-生育酚；殼聚糖納米粒；表征；緩釋；抗氧化

納米技術(shù)是近年來(lái)極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于化工、電子、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[1]。納米粒是納米技術(shù)中較為常用的載體之一，在微粒給藥系統(tǒng)以及活性包裝領(lǐng)域的應(yīng)用研究日趨普遍。基于不同方法制備的納米顆粒具有較好的生物相容性、靶向性和緩釋性，能有效提高諸多生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性及生物利用率[2-3]。在食品領(lǐng)域，納米粒已作為氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等功能性營(yíng)養(yǎng)助劑的新型輸送載體，具有提高活性成分物理靶向性，增加其穩(wěn)定性，控制其緩慢釋放等優(yōu)勢(shì)[4]。尤其對(duì)難溶性活性成分具有良好的增溶作用，可提高其生物利用度，增強(qiáng)作用效果[1,5]。此外，在食品活性包裝領(lǐng)域，納米粒也常作為防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑的載體制備具有抗氧化抑菌活性的緩釋包裝膜[6]。通過包裝材料向食品中緩慢釋放活性物質(zhì)，具有消耗活性成分少，卻能起到長(zhǎng)效作用的優(yōu)勢(shì)[7]。

殼聚糖（chitosan，CS）是甲殼素脫乙酰得到的天然多糖中唯一的陽(yáng)離子堿性氨基多糖，安全無(wú)毒，具有良好的生物相容性和生物降解性，可包封帶負(fù)電荷高聚物藥物，是一種優(yōu)良的藥物載體[8]。相比于蛋白、多肽、磷脂等較難大量獲取的壁材，CS來(lái)源廣泛，成本低廉，將其作為壁材包埋藥物，其制備工藝簡(jiǎn)單，且陽(yáng)離子堿性氨基可受環(huán)境pH值的影響實(shí)現(xiàn)所包埋藥物的控制釋放[9]。此外，CS本身具有較好的成膜性和廣譜抗菌性，適用于可食性涂膜緩釋材料的大批量制備[10]。近年來(lái)CS逐漸成為生物醫(yī)學(xué)工程以及藥物、基因載體等領(lǐng)域研究較多的材料之一，尤其是在藥物的控釋、緩釋、靶向以及智能釋藥系統(tǒng)中的應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注[11-12]。王舒舒[13]利用離子凝膠法制備了苦丁茶多酚-殼聚糖納米粒，增加了苦丁茶多酚的穩(wěn)定性，提高了生物利用度，同時(shí)還具有緩釋作用。武陶[10]通過離子凝膠法制備的山梨酸納米防腐顆粒具有較好的穩(wěn)定性和緩釋性，擴(kuò)大了山梨酸在肉品保鮮上的應(yīng)用。Seyed等[14]用兩步法制備殼聚糖納米粒，將牛至精油包埋成納米顆粒，起到了緩釋精油活性成分的效果。殼聚糖納米粒的主要制備方法包括乳化交聯(lián)法、乳化液滴法、沉淀析出法、反相膠束法、化學(xué)修飾殼聚糖法和離子凝膠法等[15]。與其他方法相比，離子凝膠法能在溫和條件下生成平均粒徑幾十至數(shù)百納米的殼聚糖納米粒，不使用有機(jī)溶劑和醛類交聯(lián)固化劑，反應(yīng)過程簡(jiǎn)便迅速，極具實(shí)用價(jià)值[8,16]。

α-生育酚是自然界廣泛存在的脂溶性維生素，具有明顯的抗氧化能力，能起到清除自由基的作用，同時(shí)還具有促進(jìn)人體新陳代謝、增強(qiáng)機(jī)體耐力、提高免疫力、美容護(hù)膚以及抗衰老等生理功能，因此常常被作為天然抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)助劑應(yīng)用于食品中，美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)將其分類為公認(rèn)安全的食品添加劑[17]。但是由于α-生育酚對(duì)光、氧、金屬離子敏感，且不溶于水，極大地限制了其生物利用度。為此，越來(lái)越多的研究者采用納米技術(shù)將α-生育酚之類的活性物質(zhì)進(jìn)行包埋，制備成納米顆粒，達(dá)到長(zhǎng)效緩釋的作用，以提高其生物利用度[18-19]。

本研究選擇α-生育酚作為被包埋的活性物質(zhì)，通過乳化-離子凝膠兩步法制備α-生育酚殼聚糖納米粒（α-tocopherol chitosan nanoparticles，α-TOCCSNPs），考察影響其形成的主要因素。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，測(cè)定其包封率及緩釋抗氧化性能，以期將α-TOCCSNPs應(yīng)用于食品貯藏中長(zhǎng)效抗氧化防腐保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS（脫乙酰度≥90%） 上海瑞永生物科技有限公司；三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）Sigma A ldrich試劑（中國(guó)）有限公司；α-生育酚 上海阿拉丁試劑有限公司；氫氧化鈉、冰乙酸等均為分析純；所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

MS-01加熱型磁力攪拌器 美國(guó)精騏有限公司；A lleg ra64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckm an公司；UV-2600紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Zetasizer Nano-Zeta電位儀 英國(guó)馬爾文公司；tensor27傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司；evo18掃描電子顯微鏡德國(guó)蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 α-TOCCSNPs的制備

根據(jù)Hosseini等[14]和Keaw chaoon等[20]的方法稍作改動(dòng)，采用乳化-離子凝膠兩步法制備。

稱取一定量的CS粉末，溶于體積分?jǐn)?shù)1%的冰乙酸溶液室溫下攪拌過夜至澄清溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為4.8，配制成5 mg/m L的CS溶液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用超純水將CS溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度后備用。

稱取一定量的TPP粉末，用超純水溶解得到與CS溶液質(zhì)量濃度一一對(duì)應(yīng)的濃度梯度的交聯(lián)劑溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，2～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

量取一定量的CS溶液于錐形瓶中，100 W超聲處理10 m in。置于恒溫磁力攪拌器上，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的Tween 80，60 ℃加熱攪拌30 m in，得到均一溶液。

稱取一定量的α-生育酚，溶于無(wú)水乙醇。配制不同質(zhì)量濃度的α-生育酚溶液，緩慢加入CS溶液中，持續(xù)溫和攪拌。

將制得的CS與生育酚的混合溶液置于磁力攪拌器上冰水浴攪拌，用注射器往其中逐滴加入2～4 ℃的TPP溶液，滴加速度1滴/s，溫和攪拌30 m in，得到淡藍(lán)色乳光溶液即為α-TOCCSNPs懸液。

按以上相同的步驟，往CS溶液中滴加TPP溶液，但不加入α-生育酚，即得到殼聚糖空白納米粒（CSNPs）溶液。

1.3.2 α-TOCCSNPs理化性能表征

1.3.2.1 平均粒徑、多分散系數(shù)及表面電位的測(cè)定

將在不同條件下制備得到的納米粒溶液用馬爾文納米粒度基于動(dòng)態(tài)光散射（dynam ic light scattering，DLS）原理測(cè)定儀測(cè)定其水合平均粒徑、表面電位以及多分散系數(shù)。

1.3.2.2 形態(tài)學(xué)觀察

通過掃描電子顯微鏡觀察納米粒的外觀形態(tài)：取一滴懸浮液，滴于光面鋁架上，自然干燥后噴金處理，置于掃描電鏡樣品臺(tái)上，加速電壓為5 kV，觀察其形態(tài)。

1.3.2.3 紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜檢測(cè)分析CS、CSNPs、α-TOCCSNPs的結(jié)構(gòu)變化。取CS、CSNPs和α-TOCCSNPs樣品置于液體樣品池中，放入樣品室，使用紅外目標(biāo)自動(dòng)識(shí)別附件掃描64 次，測(cè)定紅外光譜。

1.3.3 α-生育酚包封率的測(cè)定

1.3.3.1 α-生育酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取α-生育酚50 mg，用無(wú)水乙醇溶解，定容至100 m L，配制成0.5 mg/m L的儲(chǔ)備液。精確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L儲(chǔ)備液至10 m L棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，作為待測(cè)液。以無(wú)水乙醇為空白在292 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，得到α-生育酚吸光度與質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=7.594 3X-0.045 8（R2=0.999 4）。

1.3.3.2 α-TOCCSNPs包封率測(cè)定

根據(jù)Keaw chaoon等[20]所述方法，采用紫外分光光度法測(cè)定α-生育酚的含量。取100 μL α-TOCCSNPs懸液于10 m L離心管中，加入5 m L 2 mol/L HCl溶液，95 ℃煮沸30m in，冷卻，加入1 m L無(wú)水乙醇混合均勻，用高速離心機(jī)在25 ℃、9 000 r/m in條件下離心5 m in。取上清液用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描測(cè)定，可通過α-生育酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和292 nm波長(zhǎng)處的吸光度計(jì)算得到α-生育酚的含量。用等體積空白納米粒懸液作為空白樣以同樣的方法測(cè)定。通過公式（1）計(jì)算其包封率（encapsulation efficiency，EE）：

式中：m總為體系中α-生育酚的總質(zhì)量/mg；m游為體系中游離的α-生育酚質(zhì)量/mg。

1.3.4 納米粒體外緩釋性能分析

參照文獻(xiàn)[20-22]所述方法，略微改動(dòng)。在不同pH值的緩沖液：醋酸鹽緩沖液（pH 3.5）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、硼酸鹽緩沖液（pH 9.18）中分別進(jìn)行α-TOCCSNPs的體外緩釋性能測(cè)定。取500 μL α-TOCCSNPs分散溶液于1.5 m L離心管中25 ℃、9 000 r/m in離心5 m in，取上清液，加入800 μL緩沖液重懸，室溫下孵化。每隔一定時(shí)間將樣品在25 ℃、9 000 r/m in離心5 m in，取800 μL上清液于10 m L離心管中，加入5 m L緩沖液，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)處掃描測(cè)定，根據(jù)α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其釋放量，根據(jù)公式（2）計(jì)算其累計(jì)釋放率。每次取樣分析后往原離心管中補(bǔ)充等量新鮮的緩沖液，重懸后繼續(xù)孵化。

式中：Mt為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的α-生育酚累計(jì)釋放量；t為體外釋放時(shí)間；M0為初始載α-生育酚含量。

1.3.5 α-TOCCSNPs體外抗氧化性能分析

參照Esmaeili等[23]的方法進(jìn)行DPPH自由基清除率測(cè)定，略微改動(dòng)。將9 m L質(zhì)量濃度為1 mg/m L的α-生育酚溶液與含等量α-生育酚的殼聚糖納米粒溶液各自加入3 m L濃度為10-4m o l/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d ipheny l-2-p ic ry lhyd razy l，DPPH）甲醇溶液得到混合液。將混合液放入暗室反應(yīng)30、60、90、120、150 m in，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處混合液的吸光度。每個(gè)樣品做6 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。DPPH自由基清除率根據(jù)公式（3）計(jì)算：

式中：A0為空白DPPH在517 nm處的吸光度；A517nm為樣品溶液在517 nm處的吸光度。

1.3.6 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)

選取因素：攪拌速率500 r/min、CS質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、TPP質(zhì)量濃度1.5 mg/m L、CS與TPP質(zhì)量比5∶1、α-生育酚質(zhì)量濃度1.0 mg/m L、CS溶液pH 4.8，固定以上條件，考察單一因素對(duì)殼聚糖納米粒平均粒徑、表面電位及包封率的影響。各因素取值分別為CS質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/m L）、攪拌速率（300、500、700、900、1 100 r/m in）、pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、CS與TPP質(zhì)量比（1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1）、α-生育酚質(zhì)量濃度（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/m L）。

1.3.6.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取CS質(zhì)量濃度、CS與TPP質(zhì)量比、pH值、α-生育酚質(zhì)量濃度為主要因素，以平均粒徑和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)[24-25]。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用Excel 2013、Origin 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析，每組實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-TOCCSNPs制備單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 CS對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖1 CS質(zhì)量濃度對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 1 Effect of CS concentration on average particle size and surface potential

由圖1可知，α-TOCCSNPs平均粒徑及表面電位都隨CS質(zhì)量濃度的增加而增大。主要原因是隨著CS溶液質(zhì)量濃度增大，CS分子間距減小，分子間氫鍵作用力增強(qiáng)，較多的分子鏈間的交聯(lián)增多，隨后與單個(gè)TPP分子結(jié)合形成顆粒較大的粒子[26]。此外，由于CS分子的氨基質(zhì)子化作用，使得溶液整體帶正電荷。CS濃度越大，體系中帶正電荷的分子越多，溶液表面電位呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)[27]。

2.1.2 CS與TPP質(zhì)量比對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖2 CS與TPP質(zhì)量比對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 2 Effect of mass ratio betwen CS and TPP on average particle size and surface potential

由圖2可知，隨著CS與TPP質(zhì)量比的減小，即隨著TPP質(zhì)量的增加，納米粒平均粒徑呈現(xiàn)先下降后顯著上升的趨勢(shì)，表面電位呈現(xiàn)顯著減小的趨勢(shì)。當(dāng)CS與TPP質(zhì)量比為9∶1時(shí)，少量帶負(fù)電的TPP磷酸基團(tuán)與過量CS分子鏈上帶正電的質(zhì)子化氨基基團(tuán)結(jié)合，但是由于交聯(lián)密度小，氨基結(jié)合位點(diǎn)未被充分結(jié)合，形成納米顆粒較為松散。隨著TPP質(zhì)量的增加，體系中負(fù)電基團(tuán)增多，與CS鏈上的氨基結(jié)合位點(diǎn)充分交聯(lián)。當(dāng)CS與TPP質(zhì)量比為7∶1時(shí)，交聯(lián)密度增大，同一分子鏈上未被結(jié)合的氨基位點(diǎn)被結(jié)合，鏈間距進(jìn)一步縮小靠攏，使得納米粒平均粒徑進(jìn)一步減小，形成平均粒徑為152 nm單分散性較好的納米粒子，表面電位32.2 mV，體系穩(wěn)定。當(dāng)TPP的質(zhì)量繼續(xù)增加時(shí)，CS分子鏈上的交聯(lián)位點(diǎn)被充分結(jié)合，額外的磷酸基團(tuán)引起更多的CS分子參與到納米粒的交聯(lián)當(dāng)中，使得粒子平均粒徑顯著增加。當(dāng)TPP多到一定程度時(shí)，粒子平均粒徑已經(jīng)從納米級(jí)增加到微米級(jí)，粒子表面電荷密度無(wú)法維持體系的穩(wěn)定，粒子間靜電排斥力無(wú)法抵抗重力作用從而產(chǎn)生絮狀沉淀[28]。離子表面電荷是維持體系穩(wěn)定的重要因素，TPP質(zhì)量的增加使得CS上的氨基被中和，表面電位顯著下降。

2.1.3 pH值對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖3 CS溶液pH值對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 3 Effects of initial CS solution pH on average particle size and surface potential

由圖3可知，CS溶液初始pH值從3.5升到5.5，納米粒平均粒徑先下降后急劇上升，表面電位呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。CS溶液的初始pH值對(duì)于殼聚糖納米粒的形成至關(guān)重要[28-29]。在酸性環(huán)境下，H+與CS分子鏈上的—NH2結(jié)合，氨基質(zhì)子化形成聚電解質(zhì)溶液，使得—NH3+與TPP中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)得以交聯(lián)形成pH值可控的納米顆粒。當(dāng)pH值小于4.5時(shí)，強(qiáng)質(zhì)子化作用使得CS分子鏈上氨基被充分質(zhì)子化，溶液正電荷密度較大，表面電位較高，分子內(nèi)靜電排斥作用較強(qiáng)，CS分子鏈得以伸展，導(dǎo)致形成平均粒徑稍大的α-TOCCSNPs。當(dāng)pH值在4.5～5之間時(shí)，相對(duì)減弱質(zhì)子化作用使得分子間排斥力減弱，正負(fù)離子交聯(lián)作用大于排斥作用，納米粒平均粒徑進(jìn)一步減小。在pH值為5時(shí)，平均粒徑達(dá)到最小203 nm。而當(dāng)pH值繼續(xù)增大，CS分子中—NH3+減少，CS與TPP間的交聯(lián)作用變小，易形成大顆粒絮狀沉淀，溶液表面電位的持續(xù)下降導(dǎo)致體系穩(wěn)定性顯著下降。

2.1.4 攪拌速率對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響

圖4 攪拌速率對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 4 Effect of stirring speed on average particle size and surface potential

由圖4可知，當(dāng)攪拌速率不斷增大時(shí)，α-TOCCSNPs平均粒徑呈現(xiàn)整體減小后略微增大的趨勢(shì)，表面電位呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。較低的攪拌速率使得通過逐滴滴加法制備的α-TOCCSNPs在交聯(lián)劑TPP剛滴入CS溶液中時(shí)，無(wú)法完全分散，導(dǎo)致局部TPP濃度過高，易產(chǎn)生凝聚，形成平均粒徑較大的顆粒[25]。隨著攪拌速率的增大，加入的TPP液滴被分散均勻，同時(shí)部分長(zhǎng)鏈CS分子也會(huì)在高攪拌速率下斷裂成短鏈分子。從而使得CS與TPP的帶電基團(tuán)充分交聯(lián)形成平均粒徑更小的納米顆粒。在900 r/m in轉(zhuǎn)速時(shí)，顆粒平均粒徑達(dá)到最小172 nm，此時(shí)表面電位為33.4 m V。當(dāng)轉(zhuǎn)速進(jìn)一步增大時(shí)，其平均粒徑有略微上升，可能是因?yàn)楦咿D(zhuǎn)速下的高剪切力破壞了粒子間的靜電排斥力及水化層阻隔，造成了粒子間的聚集，使得粒子單分散性下降[26]。此外，隨著轉(zhuǎn)速的增大，使得CS分子在醋酸溶液中充分溶解，質(zhì)子化作用使得正電荷密度變大，最終納米顆粒表面電位增大。

2.1.5 α-生育酚對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響

由圖5可知，隨著α-生育酚質(zhì)量濃度的增大，納米粒平均粒徑呈整體下降后略有上升的趨勢(shì)，表面電位呈下降趨勢(shì)。當(dāng)α-生育酚質(zhì)量濃度為1.25 mg/m L時(shí)，所得納米粒平均粒徑最小，為208 nm。由于α-生育酚分子含酚羥基，其與CS分子間會(huì)形成氫鍵，兩者的結(jié)合加上TPP的交聯(lián)作用，促進(jìn)了α-TOCCSNPs的形成[30]。α-生育酚質(zhì)量濃度的增加，使得CS分子中更多的氨基被結(jié)合，從而在一定程度上降低了表面電位。但在一定量CS的體系中，所能形成的納米粒數(shù)量有限。隨著被包埋的α-生育酚達(dá)到飽和，剩余的α-生育酚分子吸附于納米粒表面，一定程度上增大了顆粒水合平均粒徑[31]。

圖5 α-生育酚質(zhì)量濃度對(duì)納米粒平均粒徑及表面電位的影響Fig. 5 Effect of α-tocopherol concentration on average particle size and surface potential

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design w ith experimental results

根據(jù)表2結(jié)果，采用極差分析法分析正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)。各因素對(duì)顆粒平均粒徑的影響主次因素為：CS質(zhì)量濃度＞CS與TPP質(zhì)量比＞pH值＞α-生育酚質(zhì)量濃度。各因素對(duì)包封率影響主次因素為：CS質(zhì)量濃度＞pH值＞α-生育酚質(zhì)量濃度＞CS與TPP質(zhì)量比。按照平均粒徑越小為優(yōu)的原則，最優(yōu)工藝組合為A1B2C2D3，制得的α-TOCCSNPs平均粒徑約為153 nm，包封率為44.51%。按包封率越高為優(yōu)的原則，最優(yōu)工藝組合為A1B2C2D2，制得的α-生育酚納米粒平均粒徑約為214 nm，包封率為51.65%。為制備較高包封效果的納米粒，最終確定選用最優(yōu)工藝為A1B2C2D2，即CS質(zhì)量濃度1.0 mg/m L，CS與TPP質(zhì)量比為7∶1，CS初始pH值為4.5，α-生育酚質(zhì)量濃度為1.0 mg/m L。

2.3 α-TOCCSNPs的表征

2.3.1 最優(yōu)工藝條件下制得的納米粒平均粒徑分布及表面電位

圖6 最優(yōu)工藝條件下α-TOCCSNPs粒徑分布圖Fig. 6 Average particle size distribution of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles p repared under the op timal conditions

圖7 最優(yōu)工藝條件下α-TOCCSNPs表面電位圖Fig. 7 Zeta potential distribution of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles prepared under the optimal conditions

如圖6、7所示，α-TOCCSNPs平均粒徑為215 nm，多分散系數(shù)為0.275，小于0.3，表面電位為31.1 m V，大于30 mV，表明在最優(yōu)工藝制備條件下納米顆粒分散性良好，粒徑分布均勻，體系穩(wěn)定，適用于后期研究[32-33]。

2.3.2 納米粒掃描電鏡圖

圖8 α-TOCCSNPs掃描電鏡圖Fig. 8 SEM image of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles

從圖8可以看到，制備的納米顆粒接近球形，分散性良好，粒徑分布均勻，與DLS測(cè)得結(jié)果一致。

2.3.3 紅外光譜分析

圖9 CS、CSNPs、α-TOCCSNPs紅外光譜圖Fig. 9 FTIR spectra of CS, CSNPs and α-TOCCSNPs

由圖9可見，CS溶液、CSNPs、α-TOCCSNPs在特征峰吸收區(qū)3 000～3 500、1 500～1 700、1 000～1 500 cm－1有著不同的吸收峰。吸收峰在3 300～3 450 cm－1段與CS分子中羥基、氨基、酰胺基的伸縮振動(dòng)有關(guān)[34]。CS在此處的吸收峰為3 402.15 cm－1，而在CSNPs和α-TOCCSNPs中，該峰轉(zhuǎn)移到了3 346.31 cm－1和3 313.45 cm－1處，分子內(nèi)、分子間氫鍵的作用使得伸縮振動(dòng)頻率向低波數(shù)方向移動(dòng)，峰形變寬，表明了CS與TPP之間的氫鍵作用加強(qiáng)。α-TOCCSNPs比CSNPs多轉(zhuǎn)移了32.86 cm－1，可能是α-生育酚與CS分子中未被交聯(lián)的氨基基團(tuán)相互作用的結(jié)果[34]。在1 500～1 700 cm－1段，CS吸收峰為1 695.52 cm－1，而CSNPs和α-TOCCSNPs的吸收峰轉(zhuǎn)移到了1 637.49、1 608.75 cm－1處，表示在CSNPs和α-TOCCSNPs中，TPP的磷酸基團(tuán)與CS的—NH2、—CONH2都發(fā)生了交聯(lián)。在1 379.67 cm－1處，α-TOCCSNPs出現(xiàn)了一個(gè)小峰，是由于在α-生育酚分子的酚羥基發(fā)生面內(nèi)彎曲振動(dòng)所致，說明α-生育酚的—OH與CS分子間存在相互作用[35]。CS形成CSNPs和α-TOCCSNPs后還出現(xiàn)了1 261.47 cm－1和1 242.67 cm－1的峰，表示了C—N發(fā)生伸縮振動(dòng)，說明了氨基在CSNPs和α-TOCCSNPs形成的過程中發(fā)生了交聯(lián)作用。另外，在1 053.2、1 012.54 cm－1處，α-TOCCSNPs出現(xiàn)了C—O—C的對(duì)稱拉伸，再次說明了CS與α-生育酚之間也存在相互作用，也證明了α-生育酚被成功包埋形成α-TOCCSNPs中[36]。

2.3.4 體外緩釋性能

圖10 不同pH值緩沖液條件下α-TOCCSNPs累計(jì)釋放曲線Fig. 10 Cumulative release curve of α-tocopherol chitosan nanoparticles at different buffer pH values

緩釋性能是載藥納米顆粒的重要性能指標(biāo)，其可以保持活性物質(zhì)在體系中緩慢釋放，達(dá)到長(zhǎng)效作用。圖10中，α-TOCCSNPs在不同pH值的緩沖液環(huán)境中有著不同的緩釋效果[37]。在0～12 h內(nèi)，納米粒表現(xiàn)出明顯的突釋效應(yīng)，由于納米粒表面有部分α-生育酚附著，較易從體系中釋放出來(lái)，前期α-生育酚的累計(jì)釋放量很高[23]。在

24 h后，納米粒進(jìn)入緩釋階段且不同pH值環(huán)境下的納米粒呈現(xiàn)出不同的緩釋速度。載藥顆粒的藥物釋放分為體系瓦解、表面侵蝕、去吸附作用、擴(kuò)散等階段。因此，體系中藥物釋放的關(guān)鍵在于藥物從顆粒中向外界介質(zhì)擴(kuò)散的過程以及聚合物基質(zhì)的降解。在pH值為7.4的緩沖液中，α-生育酚緩釋量明顯小于在pH值為3.5和9.18緩沖液中的釋放量。這是因?yàn)樵谒嵝越橘|(zhì)中，高濃度的H+滲透進(jìn)入納米粒，發(fā)生強(qiáng)質(zhì)子化作用，使得質(zhì)子化—NH3+之間的排斥力不斷加大，最終導(dǎo)致納米粒膨脹破裂，促進(jìn)了α-生育酚的較大釋放。而在堿性介質(zhì)中，由于OH-的作用，殼聚糖鏈上的氨基發(fā)生較強(qiáng)的去質(zhì)子化作用，導(dǎo)致CS與TPP之間的交聯(lián)作用被弱化甚至消失，納米顆粒逐步被破壞，α-生育酚得到大量的釋放[23,38]。綜上可得，α-TOCCSNPs是具有較好的緩釋作用，且其釋放量可通過pH值進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到控制釋放的目的[21]。

2.3.5 體外抗氧化性能

圖11 α-TOCCSNPs DPPH自由基清除率Fig. 11 DPPH free radical scavenging effect of α-tocopherol chitosan nanoparticles

由圖11可得，α-生育酚和α-TOCCSNPs進(jìn)行的體外DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，α-TOCCSNPs的自由基清除率比未包埋的α-生育酚低是因?yàn)榧{米粒中的抗氧化劑釋放需要一定的時(shí)間，這也印證了其具有緩釋作用[39]。α-生育酚是一類與自由基能夠發(fā)生快速結(jié)合的非酶類自由基清除劑。在60 m in后，α-生育酚的DPPH自由基清除率基本保持不變，說明α-生育酚已被反應(yīng)完畢，失去了繼續(xù)抗氧化的作用。而α-TOCCSNPs在30～150 m in內(nèi)具有持續(xù)的抗氧化作用，且DPPH自由基清除率不斷上升[23]。它在延長(zhǎng)抗氧化作用時(shí)間的同時(shí)還有效地保護(hù)了抗氧化劑不被破壞，實(shí)現(xiàn)了α-生育酚的長(zhǎng)效抗氧化作用[21]。

3 結(jié) 論

本研究通過乳化-離子凝膠兩步法成功制備了α-TOCCSNPs，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了其制備工藝：CS質(zhì)量濃度1 m g/m L，α-生育酚質(zhì)量濃度1 mg/m L，CS與TPP質(zhì)量比7∶1，CS初始pH值為4.5，攪拌速率900 r/m in。所得納米顆粒平均粒徑為214 nm，包封率為51.65%。此外，通過體外緩釋抗氧化實(shí)驗(yàn)證明，α-TOCCSNPs是可受pH值調(diào)控具有緩釋效果的納米材料，可有效延長(zhǎng)生育酚的抗氧化效果，提高其利用率，解決其在諸多應(yīng)用中的環(huán)境限制，為將其應(yīng)用于腌臘肉制品、果蔬等食品長(zhǎng)效抗氧化活性包裝提供較好的指導(dǎo)意義[40-42]。

[1] RASH ID I L, KHOSRAV I-DARAN I K. The app lications o f nanotechnology in food industry[J]. Critical Reviews in Food Science &Nutrition, 2011, 51(8): 723-730. DOI:10.1080/10408391003785417.

[2] STARK W J, STOESSEL P R, WOHLLEBEN W, et al. Industrial applications of nanoparticles[J]. Chem ical Society Reviews, 2015,44(16): 5793-5805. DOI:10.1039/C4CS00362D.

[3] M ALAM Y, LIM E J, SEIFALIAN A M. Cu rren t trends in the app lication o f nanopartic les in d rug delivery[J].Cu rren t M ed icina l Chem istry, 2011, 18(7): 1067-1078.DOI:10.2174/092986711794940860.

[4] FATHI M, MART N á, MCCLEMENTS D J. Nanoencapsulation of food ingredients using carbohydrate based delivery systems[J]. Trends in Food Science & Technology, 2014, 39(1): 18-39. DOI:10.1016/j.tifs.2014.06.007.

[5] 李苗苗. 天然活性成分的包埋及穩(wěn)定性研究[D]. 北京: 北京化工大學(xué), 2015: 7-9.

[6] ALMEIDA A C S, PEIXOTO F M, MELO N R, et al. Application of nanothecnology in food packaging[J]. Polímeros, 2015, 25.DOI:10.1590/0104-1428.2069.

[7] 韓甜甜. 新型緩釋型食品抗氧化包裝膜的研發(fā)[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué),2014: 7-14.

[8] 劉慧. 殼聚糖微球/納米粒的制備及其性能研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2007: 12-36.

[9] 王錚. pH-響應(yīng)性聚氨基酸類高分子的合成及其藥物控制釋放研究[D].天津: 南開大學(xué), 2011: 15-18.

[10] 武陶. 山梨酸納米粒的制備及其在肉品保鮮上的應(yīng)用[D]. 咸陽(yáng):西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014: 6-25.

[11] MOGHANJOUGHI A A, KHOSHNEVIS D, ZARRABI A. A concise review on smart polymers for controlled drug release[J]. Drug Delivery &Translational Research, 2016, 6(3): 1-8. DOI:10.1007/s13346-015-0274-7.

[12] 高艷, 王瑄, 萬(wàn)明, 等. 殼聚糖微球的制備及其在藥物載體中的應(yīng)用[J]. 功能材料, 2015, 46(2): 2007-2012. DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2015.02.002.

[13] 王舒舒. 苦丁茶多酚-殼聚糖納米微球的制備及其性能評(píng)價(jià)[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 9-28.

[14] HOSSEINI S F, ZANDI M, REZAEI M, et al. Tw o-step method for encapsulation of oregano essential oil in chitosan nanoparticles:preparation, characterization and in vitro release study[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 95(1): 50-56. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.02.031.

[15] TAJM IR-RIAHI H A, NAFISI S, SANYAKAMDHORN S, et al.Applications of chitosan nanoparticles in drug delivery[J]. Methods in Molecular Biology, 2014, 1141(1141): 165-184. DOI:10.1007/978-1-4939-0363-4_11.

[16] 曾海燕. 殼聚糖納米粒子的制備及其穩(wěn)定皮克林乳液的研究[D].無(wú)錫: 江南大學(xué), 2015: 4-18.

[17] 張婧菲, 胡志萍, 王恬. 天然維生素E及其衍生物的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè), 2015(8): 31-35.

[18] ARESTA A, CALVANO C D, TRAPANI A, et al. Development and analytical characterization of vitam in(s)-loaded chitosan nanoparticles for potential food packaging applications[J]. Journal of Nanoparticle Research, 2013, 15(4): DOI:10.1007/s11051-013-1592-7.

[19] QUINONES J P, GOTHELF K V, KJEMS J, et al. Self-assembled nanoparticles of modified-chitosan conjugates for the sustained release of DL-alpha-tocopherol[J]. Carbohydr Polym, 2013, 92(1): 856-864.DOI:10.1016/j.carbpol.2012.10.005.

[20] KEAWCHAOON L, YOKSAN R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles[J].Co lloids Surfaces B: Bioin terfaces, 2011, 84(1): 163-171.DOI:10.1016/j.colsurfb.2010.12.031.

[21] ALISHAHI A, M IRVAGHEFI A, TEHRANI M R, et al. Shelf life and delivery enhancement of vitam in C using chitosan nanoparticles[J].Food Chem istry, 2011, 126(3): 935-940. DO I:10.1016/j.foodchem.2010.11.086.

[22] CHO Y, K IM J T, PARK H J. Size-controlled self-aggregated N-acy l chitosan nanopartic les as a v itam in C carrier[J].Carbohydrate Polymers, 2012, 88(3): 1087-1092. DOI:10.1016/j.carbpol.2012.01.074.

[23] ESMAEILI A, ASGARI A. In vitro release and biological activities of Carum copticum essential oil (CEO) loaded chitosan nanoparticles[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 81: 283-290. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2015.08.010.

[24] NORONHA C M, GRANADA A F, DE CARVALHO S M, et al.Op tim ization o f α-tocophero l loaded nanocapsu les by the nanoprecipitation method[J]. Industrial Crops and Products, 2013, 50:896-903. DOI:10.1016/j.indcrop.2013.08.015.

[25] 武陶, 丁武. 山梨酸納米防腐顆粒的制備、表征及其緩釋性能[J].食品科學(xué), 2014, 35(10): 57-61. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201410011.

[26] 范聞. 單分散殼聚糖納米粒子的制備及其載體應(yīng)用的研究[D].武漢: 湖北大學(xué), 2011: 10-23.

[27] GAO Q, WAN A. Effects of molecular weight, degree of acetylation and ionic strength on surface tension of chitosan in dilute solution[J].Carbohydrate Polymers, 2006, 64(1): 29-36.

[28] FAN W, YAN W, XU Z, et al. Fo rm ation m echanism o f monodisperse, low molecular weight chitosan nanoparticles by ionic gelation technique[J]. Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 2012, 90:21-27. DOI:10.1016/j.colsurfb.2011.09.042.

[29] CA I Y, LAPITSKY Y. Formation and dissolution of chitosan/pyrophosphate nanoparticles: is the ionic crosslinking of chitosan reversible? [J]. Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 2014, 115:100-108.DOI:10.1016/j.colsurfb.2013.11.032.

[30] NAGHIBZADEH M, AMANI A, AM INI M, et al. An insight into the interactions between tocopherol and chitosan in ultrasoundprepared nanoparticles[J]. Journal of Nanomaterials, 2010, 2010: 1-7.DOI:10.1155/2010/818717.

[31] 全國(guó)芬. 肉桂精油殼聚糖納米粒的制備及在冷卻肉保藏中的應(yīng)用研究[D]. 咸陽(yáng): 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014: 5-17.

[32] JONASSEN H, KJONIKSEN A L, HIORTH M. Stability of chitosan nanoparticles cross-linked w ith tripo lyphosphate[J].Biomacromo lecu les, 2012, 13(11): 3747-3756. DOI:10.1021/bm301207a.

[33] RAMPINO A, BORGOGNA M, BLASI P, et al. Chitosan nanoparticles: preparation, size evolution and stability[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2013, 455(1/2): 219-228. DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.07.034.

[34] HU B, PAN C, SUN Y, et al. Optim ization of fabrication parameters to produce chitosan-tripolyphosphate nanoparticles for delivery of tea catechins[J]. Journal of Agriculture and Food Chem istry, 2008, 56:7451-7458.

[35] LOPEZ-LEON T, CARVALHO E L, SEIJO B, et al. Physicochemical characterization of chitosan nanoparticles: electrokinetic and stability behavior[J]. Journal of Colloid & Interface Science, 2005, 283(2):344-351. DOI:10.1016/j.jcis.2004.08.186.

[36] JOSEPH J J, SANGEETHA D, GOMATHI T. Sunitinib loaded chitosan nanoparticles formulation and its evaluation[J]. International Journal o f Bio logical M acrom o lecu les, 2016, 82: 952-958.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2015.10.079.

[37] TSAI M L, CHEN R H, BAI S W, et al. The storage stability of chitosan/tripolyphosphate nanoparticles in a phosphate buffer[J].Carbohydrate Po lymers, 2011, 84(2): 756-761. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.04.040.

[38] GOMATHI T, GOVINDARAJAN C, ROSE H R M, et al. Studies on drug-polymer interaction, in vitro release and cytotoxicity from chitosan particles excipient[J]. International Journal of Pharmaceutics ,2014, 468(1/2): 214-222. DOI:10.1016/j.ijpharm.2014.04.026.

[39] LUO Y, ZHANG B, WHENT M, et al. Preparation and characterization of zein/chitosan complex for encapsulation of alphatocopherol, and its in vitro controlled release study[J]. Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 2011, 85(2): 145-152. DOI:10.1016/j.colsurfb.2011.02.020.

[40] SIRIPATRAWAN U, NOIPHA S. A ctive film from chitosan incorporating green tea extract for shelf life extension of pork sausages[J].Food Hyd roco lloids, 2012, 27(1): 102-108. DOI:10.1016/j.foodhyd.2011.08.011.

[41] ZAMBRANO-ZARAGOZA M L, MERCADO-SILVA E, DEL REAL L A, et al. The effect of nano-coatings w ith α-tocopherol and xanthan gum on shelf-life and browning index of fresh-cut “red delicious”apples[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2014,22: 188-196. DOI:10.1016/j.ifset.2013.09.008.

[42] MOHAMMAD I A, HASHEM I M, HOSSEINI S M. Chitosan nanoparticles loaded w ith Cinnamomum zeylanicum essential oil enhance the shelf life of cucumber during cold storage[J]. Postharvest Bio logy and Techno logy, 2015, 110: 203-213. DOI:10.1016/j.postharvbio.2015.08.019.

Preparation, Characterization and in Vitro Sustained Antioxidant Activity of α-Tocopherol-Loaded Chitosan Nanoparticles

CHEN Wenbin, YAN Wenjing, XU Xinglian, ZHANG Jianhao*
(Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control,Key Lab of Meat Processing and Quality Control, M inistry of Agriculture, National Center of Meat Quality and Safety Control,College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

α-tocopherol is a natural antioxidant and nutritional supplement and has been w idely used in the food field.However, its scope of application is greatly limited due to its high susceptibility to environmental factors including oxygen,light and metal ions, ease of inactivation and water insolubility. In this study, α-tocopherol was encapsulated in chitosan nanoparticles (α-TOCCSNPs) by emulsification-ionic gelation method. To optim ize the process, the average particle size(APS) and encapsulation efficiency (EE) were investigated as a function of chitosan (CS) concentration, α-tocopherol concentration, mass ratio of CS to sodium tripolyphosphate (TPP), pH and stirring speed by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs. The CS nanoparticles were characterized by dynam ic light scattering (DLS), Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and scanning electron m icroscope (SEM) and evaluated for release profi les and antioxidant properties in vitro in order to provide a theoretical basis for the application of α-tocopherol to inhibit lipid oxidation in cured meat products during storage. The results demonstrated that the optimal conditions for preparing α-tocopherol loaded CS/TPP nanoparticles were as follow s: CS concentration, 1 mg/m L; mass ratio of CS to TPP, 7:1; pH, 4.5, and stirring speed, 900 r/m in. The APS and EE of α-tocopherol loaded nanoparticles were 214 nm and 51.65%, respectively under the optim ized conditions. The FTIR spectrum confi rmed that the encapsulation of α-tocopherol was achieved by electrostatic adsorption, and the SEM observation showed uniform average particle size distribution and regular spherical morphology.The α-tocopherol chitosan nanoparticles had sustained antioxidant activity in vitro.

α-tocopherol; chitosan nanoparticles; characterization; sustained release; antioxidant activity

2016-09-26

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303082-2）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

陳文彬（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：2014108074@njau.edu.cn

*通信作者：章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201722033

TS201.1

A

1002-6630（2017）22-0216-08

陳文彬, 嚴(yán)文靜, 徐幸蓮, 等. α-生育酚殼聚糖納米粒的制備、表征及體外緩釋抗氧化性能[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):216-223. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722033. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wenbin, YAN Wenjing, XU Xinglian, et al. Preparation, characterization and in vitro sustained antioxidant activity of α-tocopherol-loaded chitosan nanoparticles[J]. Food Science, 2017, 38(22): 216-223. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722033. http://www.spkx.net.cn