李 軍，張麗末，桂 萌，劉 蕾，郭秀鋒，李平蘭,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100071）

動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)消化道的耐受性及其微膠囊制備的研究

李 軍1，張麗末1，桂 萌2，劉 蕾1，郭秀鋒1，李平蘭1,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100071）

采用耐胃酸、耐膽鹽、模擬胃液和模擬腸液的獨(dú)立影響實(shí)驗(yàn)和連續(xù)模擬消化道實(shí)驗(yàn)考察動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)消化道環(huán)境的耐受性，結(jié)果表明：動(dòng)物雙歧桿菌RH經(jīng)各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后活菌數(shù)仍保持在107CFU/m L，經(jīng)連續(xù)模擬消化道實(shí)驗(yàn)后活菌數(shù)為106CFU/m L。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH微膠囊壁材進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：動(dòng)物雙歧桿菌RH最佳凍干保護(hù)劑各組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為甘油10%、海藻酸鈉0.5%、乳清蛋白1.5%、阿拉伯膠1.25%和大豆卵磷脂1.25%，該條件下制備的凍干微膠囊活菌數(shù)為1.80×1012CFU/g，平均包埋效率為96.04%。結(jié)論：動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)人工模擬消化道具有較好的耐受性，經(jīng)壁材優(yōu)化后制備的凍干微膠囊有較高的活菌數(shù)和較好的腸溶性。本研究為動(dòng)物雙歧桿菌RH益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

動(dòng)物雙歧桿菌RH；消化道逆環(huán)境；凍干微膠囊

隨著生活水平的提高，人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)、健康的需求也日益增長(zhǎng)。雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)、抗腫瘤等作用，已被廣泛應(yīng)用于各類食品中[1-5]。

動(dòng)物雙歧桿菌RH為本實(shí)驗(yàn)室從廣西巴馬百歲長(zhǎng)壽老人糞便中分離獲得的一株優(yōu)良菌株。劉麗莎等[6]通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定，確定雙歧桿菌RH為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種，進(jìn)一步通過(guò)PCR擴(kuò)增得到RH菌的12個(gè)與胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）生物合成有關(guān)的基因，說(shuō)明該菌自身能夠產(chǎn)生EPS[7-8]。劉蕾等[9]對(duì)該菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，基因組信息（GenBank登錄號(hào)：CP007755.1）也表明該菌株具有EPS的生物合成特性。尚楠等[10-11]采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究RH菌株調(diào)節(jié)腸道菌群平衡能力，結(jié)果表明雙歧桿菌RH的活菌、將菌體破碎后所得胞內(nèi)物及發(fā)酵后上清液都可以增加小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量，降低產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌的數(shù)量，并使腸桿菌和擬桿菌恢復(fù)至正常水平，從而改善小鼠腸道菌群組成。李輝等[12]利用細(xì)胞模型研究EPS的免疫激活作用及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果，結(jié)果表明雙歧桿菌RH合成的EPS能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性且不影響巨噬細(xì)胞增殖；通過(guò)激活宿主免疫進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤活性。郭秀鋒[13]用該菌發(fā)酵南瓜、胡蘿卜復(fù)合果蔬汁，研究結(jié)果顯示該發(fā)酵果蔬汁營(yíng)養(yǎng)豐富，酸甜適宜，口感良好，且具有較高的活菌數(shù)。以上研究結(jié)果顯示動(dòng)物雙歧桿菌RH具有益生作用，具有開(kāi)發(fā)成活性益生菌產(chǎn)品的巨大潛力。

嚴(yán)格厭氧的雙歧桿菌對(duì)環(huán)境極為敏感，環(huán)境中許多不利因素如氧氣、酸環(huán)境等均會(huì)導(dǎo)致雙歧桿菌存活率的降低，從而喪失生理活性[14-16]。通過(guò)將雙歧桿菌進(jìn)行包埋制成微膠囊，能夠較好地提高雙歧桿菌在各種不利外界環(huán)境中的存活率，可實(shí)現(xiàn)其在機(jī)體腸道較好的釋放效果。雙歧桿菌微膠囊常用的壁材有3 類：海藻酸鈉、殼聚糖和阿拉伯膠等具有成膜性的碳水化合物；乳清蛋白和酪蛋白等具有乳化性和成膜性的蛋白質(zhì)；吐溫80和卵磷脂等形成W/O乳濁液從而隔絕氧氣的脂類。目前工業(yè)上常用海藻酸鈉為壁材生產(chǎn)雙歧桿菌微膠囊[17-19]。

本研究采用人工模擬消化道環(huán)境的方法考察了動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)消化道逆環(huán)境的耐受性，并采用擠壓法制備了動(dòng)物雙歧桿菌微膠囊，探究不同壁材制備的微膠囊對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH的保護(hù)作用，提高動(dòng)物雙歧桿菌RH能夠有效抵御食品體系中的有害成分對(duì)菌體的破壞，為動(dòng)物雙歧桿菌RH在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與細(xì)胞

動(dòng)物雙歧桿菌RH（Bifidobacterium animalis subsp.lactis RH）分離自中國(guó)廣西巴馬百歲老人的糞便。動(dòng)物雙歧桿菌BB-12（Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

M RS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨1 0 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，肉浸膏10 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 m L/L，M nSO4·4H2O 0.25 g/L。MRS瓊脂培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%～1.8%瓊脂。

1.1.3 主要溶液

0.05 mol/L pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液的配制：分別配制50 m L 0.2 mol/L的甘氨酸溶液和44 m L 0.2 mol/L的鹽酸，混合后加水稀釋至200 m L；1/15 mol/L pH 6.98磷酸緩沖液的配制：將1/15 m o l/L的Na2HPO4溶液與1/15 mol/L的KH2PO4溶液按體積比3∶2的進(jìn)行混合，搖勻即可；pH 7.4磷酸鹽緩沖液的配制：稱取NaCl 8.5 g，Na2HPO42.2 g，NaH2PO40.2 g，溶于1 000 m L去離子水中，混勻，用濃鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4。

食管到胃連續(xù)過(guò)程的模擬液：向MRS肉湯培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的胃蛋白酶，分別調(diào)pH值至5.5、4.6、3.8、2.8、2.3、2.0，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾備用。十二指腸模擬液：向MRS肉湯培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%胰蛋白酶和0.3%的膽鹽，調(diào)節(jié)pH值至5.0，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾備用?；啬c模擬液：用0.1 mol/L NaHCO3溶液將十二指腸模擬液pH值調(diào)至6.5，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾備用。固化液的配制：質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%氯化鈣溶液，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5，滅菌備用。解囊液的配制：十二水合磷酸氫二鈉溶液35.8 g/L，檸檬酸溶液10.5 g/L，滅菌備用。

1.2 儀器與設(shè)備

FA 10 0 4電子分析天平 上海天平儀器廠；SPX-250B-Z恒溫水浴鍋、YXQ-LS-SⅡ壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TGL-20M臺(tái)式高速離心機(jī)長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；SCL-1300超凈工作臺(tái)北京賽伯樂(lè)儀器有限公司；S23C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；DNP-9102恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥 北京松源科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 消化道環(huán)境對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH的影響

1.3.1.1 獨(dú)立影響實(shí)驗(yàn)

耐胃酸實(shí)驗(yàn)：以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用濃鹽酸將其pH值分別調(diào)至2.0和3.0，以正常MRS培養(yǎng)基pH值為對(duì)照，充氮?dú)猓?21 ℃滅菌15 m in。按10%接種量接入活化后的動(dòng)物雙歧桿菌RH菌種，37 ℃厭氧條件下分別作用0、1 h和2 h后取樣測(cè)定活菌數(shù)。以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12為對(duì)照。

耐膽鹽實(shí)驗(yàn)：以MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，向培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的膽鹽，按照每管10 m L分裝，充氮?dú)猓?21 ℃滅菌15 m in，備用。將動(dòng)物雙歧桿菌RH按最終體系菌體濃度109CFU/m L接種量接入上述含膽鹽的培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)10 h，測(cè)定初始接種量和培養(yǎng)10 h后的活菌數(shù)，進(jìn)行比較。以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12為對(duì)照。

模擬胃液實(shí)驗(yàn)：以0.05 mol/L pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液為基礎(chǔ)，分裝到試管，充氮?dú)猓?21 ℃滅菌15 m in，再按0.5%添加量加入胃蛋白酶作為模擬胃液，按最終體系菌體濃度為109CFU/m L接種量接入已活化的動(dòng)物雙歧桿菌RH液體菌種，37 ℃厭氧條件下分別作用0、1 h和2 h后取樣測(cè)定活菌數(shù)。以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12為對(duì)照。

模擬腸液實(shí)驗(yàn)：以1/15 mol/L pH 6.98磷酸鹽緩沖液為基礎(chǔ)，分裝到試管，充氮?dú)猓?21 ℃滅菌15 m in，再按1.0%添加量加入胰蛋白酶作為模擬腸液，按10%的接種量接入已活化的動(dòng)物雙歧桿菌RH液體菌種，37 ℃厭氧條件下分別作用0 h和10 h后取樣測(cè)定活菌數(shù)。以動(dòng)物雙歧桿菌BB-12為對(duì)照。

1.3.1.2 模擬消化道體系的影響

將活力正常的動(dòng)物雙歧桿菌RH按最終體系菌體濃度為109CFU/m L的量接入食管到胃的模擬液中。在pH 5.5模擬液中作用10 m in，離心收集菌體，接入pH 4.6模擬液中處理10 m in，收集菌體，接入pH 3.8模擬液中處理10 m in，收集菌體，接入pH 2.8模擬液中處理20 m in，接入pH 2.3模擬液中處理20 m in，收集菌體，接入pH 2.0模擬液中處理20 m in，收集菌體，測(cè)定活菌數(shù)。

將所收集菌體接入十二指腸模擬液，作用1.5 h，收集菌體，取樣測(cè)定活菌數(shù)。

將所收集菌體接入回腸模擬液，作用2.5 h，收集菌體，取樣測(cè)定活菌數(shù)。以相同條件處理的動(dòng)物雙歧桿菌BB-12作為對(duì)照[20]。

1.3.2 動(dòng)物雙歧桿菌RH微膠囊的制備

1.3.2.1 菌株的活化與培養(yǎng)

將動(dòng)物雙歧桿菌RH菌種活化至2～3 代。按4%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至15 h，之后4 500 r/m in離心10 m in，棄去上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次，4 500 r/m in離心10 m in，收集菌體，獲得動(dòng)物雙歧桿菌RH菌泥，備用。

1.3.2.2 壁材的配制

甘油是公認(rèn)的應(yīng)用較多的凍干保護(hù)劑，將其添加至微膠囊壁材中，可提高雙歧桿菌的凍干存活率。劉云[21]研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甘油、3%乳清蛋白和2%海藻酸鈉制備的長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68凍干微膠囊包埋效果和成型效果好，且具有較高的包埋率。本實(shí)驗(yàn)在壁材溶液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甘油時(shí)，溶液黏度過(guò)大，嚴(yán)重影響了微膠囊的成型和包埋，因此本研究將質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甘油作為凍干保護(hù)劑添加至壁材溶液中。

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%海藻酸鈉溶液，室溫下磁力攪拌至均勻分散，4 ℃靜置過(guò)夜，確保完全溶解，備用。

在海藻酸鈉最適添加量的基礎(chǔ)上，分別向溶液中添加乳清蛋白、阿拉伯膠和大豆卵磷脂，使乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.50%、1.00%、1.50%和2.00%，阿拉伯膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.50%、1.00%和1.50%，大豆卵磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.50%、1.00%、1.50%和2.00%，室溫下磁力攪拌至均勻分散，4 ℃靜置過(guò)夜，確保完全溶解，備用。

1.3.2.3 凍干微膠囊的制備

將400 m L培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體離心后加入到160 g壁材中，使每克濕膠囊含菌量約109～1010CFU[21]，磁力攪拌混合均勻，用5 m L注射器將混合液垂直滴入磁力攪拌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% CaCl2溶液中，固化30 m in[21]，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次得到雙歧桿菌濕微膠囊。

將制備好的濕微膠囊均勻鋪滿培養(yǎng)皿，約1 cm厚，培養(yǎng)皿上覆蓋8 層紗布并扎緊，放入-20 ℃預(yù)凍12 h，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干時(shí)間約48 h[13,21]。將所得凍干微膠囊裝于壓蓋瓶中密封，貯藏于-20℃，備用。

1.3.2.4 微膠囊活菌數(shù)的確定

稱取0.1 g凍干微膠囊，溶于9.9 m L解囊液中，于37 ℃條件下進(jìn)行解囊，待完全崩解后采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)[22]測(cè)定解囊液中雙歧桿菌的活菌數(shù)。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化微膠囊壁材

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乳清蛋白（A）、阿拉伯膠（B）、大豆卵磷脂（C）為影響因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。研究各因素對(duì)微膠囊活菌數(shù)的影響，從而得到最優(yōu)凍干保護(hù)劑復(fù)配配方。

表1 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded level and corresponding actual levels of independent variables used in orthogonal array design

1.3.4 凍干微膠囊包埋效率[23-24]的測(cè)定

稱取0.1 g優(yōu)化后制備的凍干微膠囊樣品2 份，分別置于9.9 m L的磷酸鹽緩沖液（pH 4.0）和模擬腸溶液（pH 6.8）中， 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩處理45 m in，活菌計(jì)數(shù)。包埋效率計(jì)算公式[25]如下：

式中：EE為包埋效率/%；Ct為包埋于微膠囊中的雙歧桿菌活菌總數(shù)；C0為起始添加的雙歧桿菌活菌總數(shù)。

1.3.5 腸溶性實(shí)驗(yàn)

稱取0.1 g優(yōu)化后制備的凍干微膠囊樣品置于含有9.9 m L模擬腸液（pH 6.8）的厭氧管中，充氮?dú)?，?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4 h 和5 h取1 m L腸液進(jìn)行稀釋，活菌計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為3 組重復(fù)，以 ±s表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化道環(huán)境對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH的影響

2.1.1 獨(dú)立影響實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 耐胃酸實(shí)驗(yàn)

圖1 對(duì)照菌株動(dòng)物雙歧桿菌BB-12對(duì)胃酸的耐受性Fig. 1 Tolerability of the control strain to gastric acid

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)胃酸的耐受性Fig. 2 Tolerability of Bifidobacterium RH to gastric acid

由圖1和圖2可知，正常條件下培養(yǎng)動(dòng)物雙歧桿菌RH活菌數(shù)不斷增加，在pH 2.0條件下，培養(yǎng)1 h后，RH的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值由原來(lái)的（8.82±0.09）（lg（CFU/m L））降至（7.82±0.11）（lg（CFU/m L）），培養(yǎng)2 h后降至（7.30±0.03）（lg（CFU/m L））。RH菌株在此條件下1 h后降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)逐漸降低，但降低幅度相對(duì)較慢。RH菌株在pH 3.0條件下作用2 h后，活菌數(shù)降低程度較小。

動(dòng)物雙歧桿菌RH菌株的耐酸性與BB-12相當(dāng)。通常胃酸的pH值為3.0左右，流體食物在胃內(nèi)停留的時(shí)間一般為1～12 h，相對(duì)較短，在此條件下，動(dòng)物雙歧桿菌RH的活菌數(shù)能保持在較高水平，具有較強(qiáng)的耐胃酸能力。

2.1.1.2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

圖3 動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)膽鹽的耐受性Fig. 3 Tolerability of Bifidobacterium RH to bile salt

由圖3可知，動(dòng)物雙歧桿菌RH和對(duì)照菌株相比，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的膽鹽環(huán)境下，RH菌株有一定程度的生長(zhǎng)，而對(duì)照菌株卻受膽鹽環(huán)境的影響較大，活菌數(shù)大幅降低，培養(yǎng)10 h后活菌數(shù)約比培養(yǎng)0 h時(shí)降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。培養(yǎng)0 h時(shí)的活菌數(shù)是按照對(duì)照菌與實(shí)驗(yàn)菌等量接入培養(yǎng)基后，迅速進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，而0 h時(shí)RH活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明對(duì)照菌株在膽鹽環(huán)境處理瞬間即造成嚴(yán)重?fù)p失。對(duì)于大多數(shù)食物來(lái)講，10 h足以通過(guò)腸道，尤其是流體食物。研究表明，動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)人體正常的膽鹽環(huán)境具有較好的耐受作用。

2.1.1.3 模擬胃液和模擬腸液實(shí)驗(yàn)

圖4 人工模擬胃液對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH存活的影響Fig. 4 Effect of simulated gastric fluid on the survival of Bifidobacterium RH

圖5 人工模擬腸液對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH存活的影響Fig. 5 Effect of simu lated intestinal environment on the survival of Bifidobacterium RH

由圖4可以看出，R H的活菌數(shù)初始值為（9.42±0.09）（lg（CFU/m L）），在經(jīng)過(guò)模擬胃液處理1 h后，活菌數(shù)降至（8.82±0.03）（lg（CFU/m L）），處理2 h后活菌數(shù)降為（7.93±0.05）（lg（CFU/m L））。動(dòng)物雙歧桿菌RH在模擬胃液處理時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，活菌數(shù)逐漸降低，且降低幅度基本保持一致，最后依然能夠保持在較高的數(shù)量級(jí)，與對(duì)照組相當(dāng)。

由圖5可以看出，將動(dòng)物雙歧桿菌RH在人工模擬腸液中培養(yǎng)10 h后，活菌數(shù)由初始的（8.83±0.11）（lg（CFU/mL））降為（8.23±0.05）（lg（CFU/m L）），仍保持在較高活菌數(shù)水平，明顯優(yōu)于對(duì)照組在模擬腸液環(huán)境下的存活率。孟祥晨[26]研究了模擬胃液環(huán)境對(duì)幾種雙歧桿菌的影響，不同菌株耐受能力不同，并且多數(shù)菌體在胃液處理前期活菌數(shù)降低幅度大，后期降低幅度小，對(duì)于導(dǎo)致菌株對(duì)胃腸液耐受能力差異的機(jī)制尚不明確。

2.1.2 連續(xù)模擬消化道體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

人體消化道系統(tǒng)是一個(gè)連續(xù)的體系，消化管是一條起自口腔，延續(xù)為咽、食管、胃、小腸（包括十二指腸和空腸和回腸）、大腸終于肛門的肌性管道，外界食物進(jìn)入人體后，需經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程到達(dá)小腸。研究動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)人體消化道逆環(huán)境的耐受性，需要模擬連續(xù)消化道體系來(lái)展開(kāi)。雙歧桿菌活菌制劑食用時(shí)多為流體形式，在口腔及咽喉停留時(shí)間極短，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)配制食管到胃模擬液、十二指腸模擬液、系膜小腸（主要包括空腸和回腸）模擬液對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH菌株進(jìn)行連續(xù)處理，觀察雙歧桿菌RH對(duì)整個(gè)消化道逆環(huán)境的耐受性。

圖6 連續(xù)模擬消化道體系對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH存活的影響Fig. 6 Effects of continuous simu lated gastrointestinal digestion on the survival of Bifidobacterium RH

由圖6可知，將初始量為（9.41±0.17）（lg（CFU/mL））的動(dòng)物雙歧桿菌RH經(jīng)過(guò)食管到胃連續(xù)過(guò)程后，活菌數(shù)降至（8.54±0.08）（lg（CFU/m L）），通過(guò)十二指腸模擬液后，活菌數(shù)降至（7.16±0.01）（lg（CFU/m L）），通過(guò)系膜小腸模擬液后，活菌數(shù)最終降至（6.94±0.06）（lg（CFU/m L）），經(jīng)過(guò)連續(xù)腸道模擬環(huán)境后，動(dòng)物雙歧桿菌RH的活菌數(shù)仍接近107CFU/m L，對(duì)照菌株在前兩個(gè)階段與RH菌株無(wú)顯著性差異，最后一階段降低幅度較大，最終活菌數(shù)降至（6.00±0.03）（lg（CFU/m L）），顯著低于動(dòng)物雙歧桿菌RH。這說(shuō)明動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)連續(xù)的消化道逆環(huán)境具有較好的耐受性。

關(guān)于益生菌對(duì)消化道逆環(huán)境的耐受性，國(guó)內(nèi)外研究大都分別考慮菌株對(duì)胃酸的耐受性和對(duì)膽鹽的耐受性。Ranadheera等[27]研究了嗜酸乳桿菌LA-5及丙酸菌702對(duì)消化道的耐受性，分別用pH 2.0的胃酸溶液和0.3%的膽鹽溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行處理，處理2～3 h后，活菌數(shù)有顯著降低。Pan Xiaodong等[28]通過(guò)研究不同pH值及膽鹽濃度下嗜酸乳桿菌LNT的存活率來(lái)研究該菌株對(duì)消化道環(huán)境的耐受性。消化道是一個(gè)完整的體系，有必要通過(guò)連續(xù)模擬消化道環(huán)境來(lái)分析菌株對(duì)消化道的耐受性，M adureira等[29]通過(guò)四步連續(xù)過(guò)程，分析了干酪乳桿菌LAFTI-L26和嗜酸乳桿菌LAFTI-10分別經(jīng)過(guò)口腔、食管到胃、十二指腸和回腸過(guò)程后活菌數(shù)的變化，這種連續(xù)模擬方式與實(shí)際情況更接近。本實(shí)驗(yàn)除單獨(dú)消化道因素對(duì)菌體的影響之外，采用完整消化道連續(xù)模擬了消化道逆環(huán)境對(duì)RH菌體的影響，更能反映真實(shí)情況。

2.2 動(dòng)物雙歧桿菌RH微膠囊的制備

2.2.1 微膠囊壁材單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

不同壁材對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌RH的生長(zhǎng)影響如圖7所示。各因素對(duì)活菌數(shù)的影響結(jié)果表明，所選因素對(duì)活菌數(shù)的影響均為隨著添加量的增大凍干微膠囊活菌數(shù)先增長(zhǎng)后下降。

如圖7A所示，當(dāng)海藻酸鈉的添加量為0.50%時(shí)，凍干微膠囊的活菌數(shù)達(dá)到最大值，為5.50×109CFU/g，高于其他添加量（P＜0.05）。海藻酸鹽是一種從海藻中提取的帶負(fù)電荷天然大分子多糖，當(dāng)與Ca2+接觸時(shí)，海藻酸鈉結(jié)構(gòu)中的羧酸根陰離子與鈣離子之間交聯(lián)，結(jié)合成“蛋盒”式結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣，最終形成三維網(wǎng)絡(luò)狀的凝膠，將雙歧桿菌細(xì)胞截留在微膠囊中[30]。而且海藻酸鹽膠凝條件相對(duì)較溫和、安全無(wú)毒、生物相容性好且成本較低，在微生物包埋處理方面發(fā)揮著重要作用。

如圖7B所示，當(dāng)乳清蛋白添加量為1.50%時(shí)，微膠囊中活菌數(shù)達(dá)到最大（6.95×1010CFU/g），比不添加乳清蛋白活菌數(shù)高出1 個(gè)數(shù)量級(jí)（5.50×109CFU/g）。在雙歧桿菌壁材體系中添加乳清蛋白可以在雙歧桿菌體外形成蛋白膜，該膜可以保護(hù)菌體細(xì)胞，同時(shí)乳清蛋白還可以為體系提供緩沖溶質(zhì)，保持溶液的pH值相對(duì)穩(wěn)定，并固定細(xì)胞中凍干的酶類[31]；此外，乳清蛋白變性，蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，經(jīng)過(guò)相互作用形成聚集體，彌補(bǔ)了海藻酸鈉形成的多孔結(jié)構(gòu)，增加了微膠囊的強(qiáng)度，使芯材較多的截留在微膠囊中。

由圖7C可知，當(dāng)阿拉伯膠添加量為1.00%時(shí)，活菌數(shù)為3.23×1010CFU/g。阿拉伯膠為大分子多糖，含有特殊的結(jié)構(gòu)，具有成膜性。

由圖7D可知，當(dāng)大豆卵磷脂的添加量為1.00%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到9.20×1010CFU/g，此時(shí)微膠囊所含活菌數(shù)最大。體系中添加一定量的大豆卵磷脂時(shí)，有助于形成W/O的乳濁液體系，為雙歧桿菌提供厭氧的環(huán)境[23]，提高了微膠囊所含活菌數(shù)。

2.2.2 微膠囊壁材正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化壁材從而增大凍干微膠囊所含的活菌數(shù)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，凍干保護(hù)劑中乳清蛋白和大豆卵磷脂對(duì)凍干微膠囊活菌數(shù)具有顯著影響，阿拉伯膠的影響相對(duì)較小。

根據(jù)SPSS軟件分析各因素檢驗(yàn)得到正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B3C3，即乳清蛋白添加量為1.50%，阿拉伯膠添加量為1.25%，大豆卵磷脂添加量為1.25%。因此凍干保護(hù)劑中含質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%甘油，0.5%海藻酸鈉，1.5%乳清蛋白，1.25%阿拉伯膠和1.25%大豆卵磷脂。該條件下凍干微膠囊活菌數(shù)為1.80×1012CFU/g。劉云[21]以海藻酸鈉、乳清蛋白和甘油為壁材，利用擠壓法包埋長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68，凍干后每克膠囊活菌數(shù)分別為9.66和10.6 個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖7 海藻酸鈉（A）、乳清蛋白（B）、阿拉伯膠（C）和大豆卵磷脂（D）添加量對(duì)微膠囊所含活菌數(shù)的影響Fig. 7 Effects of sodium alginate (A), whey protein (B), Arabic gum (C) and soybean lecithin (D) concentration on the survival of m icroencapsuled Bifidobacterium RH

表2 壁材配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab le 2 Orthogonal array design w ith experimental resu lts

2.3 動(dòng)物雙歧桿菌濕微膠囊的形態(tài)描述

微膠囊的外觀和大小是重要的物理因素，若將其添加至食品中，會(huì)對(duì)整體的風(fēng)味、質(zhì)地和外觀有顯著的影響。經(jīng)壁材優(yōu)化后制備的動(dòng)物雙歧桿菌RH濕微膠囊形態(tài)如圖8所示，可以看出，微膠囊大小均一，表面光滑，乳白色，有光澤，呈規(guī)則球形，無(wú)拖尾現(xiàn)象，成型效果較好。對(duì)微膠囊粒徑進(jìn)行測(cè)定，粒徑大約為1～2 mm。

圖8 動(dòng)物雙歧RH濕態(tài)微膠囊形態(tài)Fig. 8 M orphology of wet m icrocapsules containing Bifidobacterium RH

2.4 包埋效率

根據(jù)1.2.4節(jié)方法得出凍干微膠囊包埋效率為96.04%，高于Holkem等[19]制備的雙歧桿菌BB-12凍干微膠囊的包埋效率（89.71%）。

2.5 腸溶性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

含有雙歧桿菌的制品必須能夠在人體腸道的堿性環(huán)境中完全快速的釋放出來(lái)，才能有效發(fā)揮其重要功效。雙歧桿菌微膠囊的腸溶性是評(píng)價(jià)凍干微膠囊的重要指標(biāo)[32]，因此本研究對(duì)壁材優(yōu)化后的凍干微膠囊進(jìn)行了腸溶性實(shí)驗(yàn)。

圖9 凍干微膠囊在模擬腸液中活菌數(shù)的變化Fig. 9 Change in survival rate of freeze-dried m icrocapsules in simulated intestinal fluid

由圖9可知，經(jīng)模擬腸液處理1 h后，微膠囊形態(tài)發(fā)生變化，開(kāi)始溶脹變大，溶液中活菌數(shù)迅速增加，達(dá)到1011CFU/g，2 h后腸液中活菌數(shù)約為1012CFU/g，此時(shí)微膠囊基本完全溶于腸液中，無(wú)明顯顆粒存在，之后雙歧桿菌活菌數(shù)趨于穩(wěn)定。說(shuō)明雙歧桿菌凍干微膠囊在腸道中2 h左右基本完全釋放。長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68凍干微膠囊在模擬腸液中2 h內(nèi)完成崩解[21]。動(dòng)物雙歧桿菌RH微膠囊具有較好的腸溶性，能夠及時(shí)地溶解將包裹的動(dòng)物雙歧桿菌RH釋放出來(lái)。

3 結(jié) 論

動(dòng)物雙歧桿菌RH及其代謝產(chǎn)物胞外多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性，具有開(kāi)發(fā)成益生菌產(chǎn)品的潛力。本研究考察了動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)消化道逆環(huán)境的耐受性，結(jié)果顯示經(jīng)各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后活菌數(shù)仍保持在107CFU/m L，經(jīng)連續(xù)模擬消化道實(shí)驗(yàn)后活菌數(shù)為106CFU/m L，符合規(guī)定的雙歧桿菌活菌體最低攝入量106CFU/m L的要求。這說(shuō)明動(dòng)物雙歧桿菌RH具有較好的消化道耐受性。動(dòng)物雙歧桿菌RH具有多重益生作用，將其開(kāi)發(fā)成益生菌產(chǎn)品是趨勢(shì)，而食品體系中有害成分會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生破壞作用，微囊化能夠有效地保護(hù)菌體抵御外界不利因素。本研究對(duì)RH微膠囊壁材進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)壁材優(yōu)化后制備的凍干微膠囊含有較高活菌數(shù)和較好的腸溶性。

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Resistance of Bifidobacterium RH to Simulated Gastrointestinal Conditions and Preparation of M icrocapsules Containing This Strain

LI Jun1, ZHANG Limo1, GUI Meng2, LIU Lei1, GUO Xiufeng1, LI Pinglan1,*
(1. Beijng Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Fisheries Research Institute, Beijing 100071, China)

The aim of this study was to evaluate the potential of Bifidobacterium RH to be used as a probiotic product. We examined the viability of the probiotic under simulated gastrointestinal conditions and we investigated the production of probiotic m icrocapsules w ith resistance to various negative factors. The bacterial counts were 107CFU/m L and 106CFU/m L,respectively, under simulated gastrointestinal conditions separately and sequentially. The optim ized wall material of m icrocasuples contained l0% glycerol, 0.50% sodium alginate, 1.50% whey protein, 1.25% Arabic gum and 1.25% soybean lecithin as determ ined by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs. The count of viable Bifidobacterial cells in the m icrocapsules was 1.80 × 1012CFU/g, and w ith respect to encapsulation efficiency, the results showed a mean value of 96.04%. Thus, the study demonstrated that m icroencapsulated Bifidobacterium RH could be resistant to simulated gastrointestinal conditions. The m icroencapsulation process was shown to efficiently increase the viability of probiotic cultures, and the microorganism was released from the microcapsules. This study may provide a theoretical and technical support for the development of probiotic products containing Bifidobacterium RH.

Bifidobacterium RH; simulated gastrointestinal conditions; m icrocapsules

10.7506/spkx1002-6630-201722003

Q939.99

A

1002-6630（2017）22-0014-08

李軍, 張麗末, 桂萌, 等. 動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)消化道的耐受性及其微膠囊制備的研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 14-21.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722003. http://www.spkx.net.cn

LI Jun, ZHANG Limo, GUI Meng, et al. Resistance of Bifidobacterium RH to simulated gastrointestinal conditions and preparation of microcapsules containing this strain[J]. Food Science, 2017, 38(22): 14-21. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722003. http://www.spkx.net.cn

2017-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271827；31671831）

李軍（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：lijun900330@126.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn