葉慶元 邱新毓 田榮 劉世宇

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

供體MSCs來源的外泌體轉(zhuǎn)運miR-26a恢復(fù)宿主MSCs功能并緩解骨質(zhì)疏松

葉慶元 邱新毓 田榮 劉世宇

目的探討移植的供體間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)通過分泌外泌體緩解雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的機制。方法建立12 只小鼠雌激素缺乏骨質(zhì)疏松模型，通過siRNA調(diào)控MSCs外泌體釋放及直接注射外泌體，明確外泌體的分泌在MSCs治療骨質(zhì)疏松中的作用；通過體外成骨分化誘導(dǎo)、茜素紅染色、qPCR明確供體MSCs來源的外泌體對宿主MSCs功能的影響；通過miR-26a模擬物、抑制物轉(zhuǎn)染、qPCR明確外泌體發(fā)揮治療作用的機制。結(jié)果供體MSCs通過分泌外泌體緩解雌激素缺乏骨質(zhì)疏松，并證明外泌體通過恢復(fù)骨質(zhì)疏松宿主MSCs成骨分化功能緩解骨質(zhì)疏松，外泌體可通過轉(zhuǎn)運miR-26a恢復(fù)骨質(zhì)疏松宿主MSCs的成骨分化功能。結(jié)論供體MSCs來源的外泌體可通過轉(zhuǎn)運miR-26a恢復(fù)宿主MSCs功能并緩解骨質(zhì)疏松。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)； 骨質(zhì)疏松； 外泌體

骨質(zhì)疏松是一種危害性和發(fā)病率都非常高的骨代謝性疾病，嚴重威脅中、老年尤其是絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松患者的健康[1]。目前骨質(zhì)疏松的治療策略尚不能從根本上逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生[2]。骨髓中的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨再生的種子細胞，對維持正常骨代謝功能起到重要作用，其成骨分化功能的缺陷是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，移植的外源性MSCs可以通過調(diào)控宿主骨髓MSCs的成骨分化功能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松[5-6]，然而其調(diào)控機制仍不明確。近期研究發(fā)現(xiàn)，移植外源性細胞通過分泌外泌體影響宿主細胞的功能[7]。外泌體是一類直徑介于30～100 nm之間具有膜結(jié)構(gòu)的分泌型小體，可穩(wěn)定轉(zhuǎn)運microRNA(miRNA)等關(guān)鍵信號分子[8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在雌激素缺乏骨質(zhì)疏松患者和雌激素缺乏小鼠骨質(zhì)疏松模型中，骨髓MSCs的成骨分化功能缺陷與miR-26a等[10-11]多種miRNAs的異常低表達密切相關(guān)。因此提出假說：移植的供體MSCs能夠通過轉(zhuǎn)運關(guān)鍵miRNA調(diào)節(jié)宿主MSCs功能并緩解骨質(zhì)疏松。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 12 周齡雌性C57BL6/J小鼠購于第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，用于骨髓MSCs的分離培養(yǎng)、卵巢摘除去勢骨質(zhì)疏松模型建立以及系統(tǒng)注射治療，動物實驗程序符合第四軍醫(yī)大學(xué)動物使用與管理委員會規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、左旋谷氨酰胺、2-巰基乙醇(Invitrogen，美國)；外泌體分離提取試劑盒(System Biosciences，美國)；蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、Western blot發(fā)光液(Thermo，美國)；β-甘油磷酸、維生素C、地塞米松、茜素紅(Sigma，美國)；microRNA及基因qPCR檢測試劑盒、microRNA模擬物及抑制物(Qiagen，美國)；抗小鼠CD63、CD81抗體、Rab27a siRNA(Santa Cruz，美國)；Opti-MEM培養(yǎng)液、Lipofectamine 3000(Life Technologies，美國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng) 取12 周齡雌性C57BL6/J小鼠股骨和脛骨，利用PBS沖出全骨髓細胞，將單細胞懸液接種于含MSCs培養(yǎng)液的10 cm直徑培養(yǎng)皿中，置于37 ℃和含5% CO2環(huán)境的細胞培養(yǎng)箱中。將貼壁克隆樣生長的MSCs傳代，第一代MSCs將用于本研究所有的實驗。

1.2.2 MSCs來源外泌體的提取 將用于MSCs培養(yǎng)的胎牛血清在105g條件下離心過夜，配置不含外泌體的MSCs培養(yǎng)液。MSCs常規(guī)培養(yǎng)3 d后利用外泌體提取試劑盒提取培養(yǎng)液上清中的外泌體，并利用蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。

1.2.3 小鼠去勢骨質(zhì)疏松模型(OVX)的建立及系統(tǒng)注射治療 選取12 周齡雌性C57BL6/J 小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)背部切口，暴露分離雙側(cè)卵巢并完全切除。體內(nèi)系統(tǒng)注射實驗中，將200 μg外泌體或106個MSCs(未經(jīng)處理或Rab27a-siRNA轉(zhuǎn)染)混懸于200 μl PBS中，經(jīng)尾靜脈注射于去勢骨質(zhì)疏松小鼠。

1.2.4 掃描電鏡 提取外泌體后，加入200 μl的2.5%戊二醛于4 ℃條件下固定12 h。然后將樣本放入含有0.5%的氫氟酸和1 mol/L的磷酸混合液中進行電鍍陽極化處理1 h。最后將整個樣本放入掃描電子顯微鏡下觀察(日立S-4800，日本)。

1.2.5 μCT檢測及相關(guān)分析 MSCs或外泌體治療4 周后，取小鼠椎骨(第四腰椎)置于固定液中充分固定，使用西門子μCT掃描股骨標本，按照相應(yīng)標準程序?qū)ψ倒沁M行360°掃描，掃描參數(shù)為：電壓160 kV、電流500 mA、分辨率10.44 μm，采用自帶 Inveon Research Workplace軟件系統(tǒng)進行3D圖像重建、圖像采集和骨密度(BMD)、骨體積分數(shù)(BV/TV)分析。

1.2.6 成骨誘導(dǎo)分化及茜素紅染色 將MSCs于含有2 mmol/L β-甘油磷酸, 100 μmol/L維生素C和10 nmol/L地塞米松的小鼠MSCs成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)，誘導(dǎo)7天后提取RNA進行qPCR檢測，誘導(dǎo)21 d后使用60%異丙醇固定細胞并使用茜素紅染色液染色。利用Image J軟件分析茜素紅染色陽性面積，并分析計算染色陽性面積占總面積的百分比值。

1.2.7 qPCR檢測 使用qPCR檢測miR-26a表達時，提取細胞總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄，最后使用Qiagen公司的miR-26a引物、RUN6引物(內(nèi)參)和qPCR試劑盒按照說明步驟在CFX96TM實時定量PCR儀中完成擴增和檢測。使用qPCR檢測Runx2表達時，使用Runx2引物、GAPDH引物(內(nèi)參)和qPCR試劑盒完成擴增和檢測。其中引物序列如下：Runx2的上游引物為5′-CAGTCCCAACTTCCTGTGCT-3′，下游引物為5′- CCCATCTGGTACCTCTCCGA-3′；GAPDH的上游引物為5′-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3′，下游引物為5′-GACGGACACATTGGGGG TAG-3′。

1.2.8 microRNA模擬物、抑制物及siRNA轉(zhuǎn)染 本研究使用siRNA轉(zhuǎn)染降低MSCs中Rab27a的表達，無效siRNA轉(zhuǎn)染作為陰性對照。使用miR-26a 抑制物和模擬物轉(zhuǎn)染抑制或過表達miR-26a，無效抑制物和模擬物作為陰性對照。為獲得低表達miR-26a的外泌體，將MSCs轉(zhuǎn)染miR-26a抑制物48 h后收集其分泌的外泌體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)在分析前進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，分別利用t檢驗和方差分析檢驗2 組或多組之間差異的顯著性，在多組之間兩兩比較時，使用Bonferroni方法進行P值的矯正，P<0.05時差異被認為具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠骨髓MSCs來源外泌體的獲得及鑒定

掃描電鏡結(jié)果顯示MSCs分泌的外泌體為球形囊泡、直徑小于100 nm(圖 1A)。提取外泌體總蛋白并利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與細胞對照相比，外泌體表達相關(guān)標志蛋白CD81和CD63(圖 1B)，證明本研究成功提取MSCs分泌的外泌體。

2.2 MSCs通過分泌外泌體恢復(fù)骨質(zhì)疏松小鼠骨量

系統(tǒng)注射MSCs能夠有效緩解骨質(zhì)疏松。為證明系統(tǒng)注射的供體MSCs是否通過分泌外泌體發(fā)揮治療作用，本研究通過siRNA下調(diào)MSCs中一種控制外泌體釋放的蛋白Rab27a[12]。μCT結(jié)果示(圖 2A)，MSCs系統(tǒng)注射4 周后顯著緩解OVX骨質(zhì)疏松癥狀，而抑制MSCs的外泌體釋放顯著抑制了MSCs的治療作用；同時，直接注射外泌體4周后也能夠顯著緩解骨質(zhì)疏松癥狀。骨密度(BMD)及骨體積分數(shù)(BV/TV)分析同樣驗證了上述結(jié)果(圖 2B)。結(jié)果證明系統(tǒng)注射的供體MSCs通過分泌外泌體緩解骨質(zhì)疏松。

圖 1 MSCs來源外泌體的鑒定

A： μCT小鼠椎骨掃描； B： 骨密度(BMD)及骨體積分數(shù)(BV/TV)分析

2.3 MSCs來源的外泌體恢復(fù)骨質(zhì)疏松小鼠MSCs成骨分化功能

為進一步探討供體MSCs如何通過外泌體緩解骨質(zhì)疏松，我們在MSCs或外泌體系統(tǒng)注射4 周后分離培養(yǎng)宿主骨髓MSCs并進行成骨分化誘導(dǎo)，茜素紅染色(圖 3A)、染色陽性面積分析(圖 3B)、Runx2表達結(jié)果(圖 3C)顯示，MSCs系統(tǒng)注射顯著恢復(fù)宿主MSCs成骨分化功能，而抑制MSCs外泌體的分泌顯著削弱了恢復(fù)作用。同時，外泌體注射產(chǎn)生了與MSCs注射相似的治療作用。在MSCs培養(yǎng)液中直接加入外泌體(20 μg/ml)，茜素紅染色(圖 3D～E)及Runx2表達顯示外泌體顯著促進了骨質(zhì)疏松宿主MSCs的成骨分化功能。此部分結(jié)果證明了供體MSCs來源的外泌體通過恢復(fù)骨質(zhì)疏松宿主MSCs的成骨分化功能緩解骨質(zhì)疏松。

2.4 供體MSCs來源的外泌體轉(zhuǎn)運miR-26a恢復(fù)宿主MSCs功能

骨髓MSCs中miR-26表達下調(diào)是MSCs分化功能缺陷及雌激素缺乏骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因[10]，本研究驗證了miR-26a在假手術(shù)組(Sham)及卵巢摘除組(OVX)的表達(圖 4A)。為驗證外泌體轉(zhuǎn)運miR-26a恢復(fù)宿主MSCs功能的假說，首先以血清為對照，發(fā)現(xiàn)外泌體中含有miR-26a(圖 4B)。進一步利用miR-26a模擬物提高MSCs中miR-26a的表達，并發(fā)現(xiàn)與低表達miR-26a的外泌體相比較，正常外泌體處理能夠更大程度提高MSCs中miR-26a的表達(圖 4C)。通過茜素紅染色及染色面積分析發(fā)現(xiàn)(圖 4D～E)，轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物能夠顯著提高骨質(zhì)疏松宿主MSCs的成骨分化功能；同時，通過對MSCs轉(zhuǎn)染miR-26a抑制物獲得低表達miR-26a的外泌體，與正常外泌體相對比，低表達miR-26a的外泌體促進MSCs成骨分化功能顯著降低，Runx2表達進一步驗證了上述結(jié)果(圖 4F)。此部分結(jié)果顯示，MSCs來源的外泌體能夠轉(zhuǎn)運miR-26a恢復(fù)骨質(zhì)疏松宿主MSCs的成骨分化功能。

A、D： 茜素紅染色； B、E： 茜素紅染色面積分析； C、F： qPCR檢測Runx2表達

A～C： qPCR檢測miR-26a表達； D： 茜素紅染色； E： 茜素紅染色面積分析； F： qPCR檢測Runx2表達

A-C： qPCR analysis of miR-26a； D： Alizarin red staining； E： Positive staining area analysis based on alizarin red staining； F： qPCR analysis of miR-26a

Fig 4 Rescue of MSC osteogenic differentiation of recipient OVX mice by exosomes through miR-26a

3 討 論

《骨質(zhì)疏松癥防治中國白皮書》指出，我國至少有6 944 萬人患有骨質(zhì)疏松，預(yù)計到2020 年我國骨質(zhì)疏松和低骨量患者將增加至2.8 億，但是目前仍無安全有效的治療方式，其主要原因為目前治療方式僅能抑制骨吸收，并不能通過促進成骨恢復(fù)骨量從而逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生。近期研究顯示，MSCs系統(tǒng)注射能夠通過恢復(fù)宿主成骨功能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松，有望成為未來治療骨質(zhì)疏松的重要手段[5-6,12]。

MSCs移植已被證明能夠在多種疾病的治療中產(chǎn)生療效，然而其機制仍然不明確。早期研究顯示，移植的MSCs能夠于宿主體內(nèi)直接分化成為多種類型細胞促進組織再生[13-14]；而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植后存活并分化的細胞數(shù)量較少，而旁分泌作用在MSCs療效產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]；近期熱點研究顯示，外泌體在MSCs產(chǎn)生治療作用的過程中同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用。以上研究說明，MSCs通過多種機制產(chǎn)生療效，并在不同疾病條件及宿主環(huán)境中發(fā)揮不同治療效果，因此，未來仍需繼續(xù)探討MSCs治療的機制，調(diào)控多種機制并優(yōu)化宿主環(huán)境，使治療效果最大化。

本研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)注射小鼠來源的供體MSCs，能夠通過分泌外泌體轉(zhuǎn)運miR-26恢復(fù)卵巢去勢小鼠的宿主MSCs功能并緩解骨質(zhì)疏松。這一發(fā)現(xiàn)也提示了microRNA與維持機體骨量代謝平衡的相關(guān)激素可能具有密切關(guān)系，為研究如何緩解與治療絕經(jīng)后婦女因激素水平下調(diào)所造成的骨質(zhì)疏松具有一定的參考價值。另外，MSCs分泌的外泌體中含有多種miRNA[8-9]，未來仍需要探討多種miRNA對骨質(zhì)疏松的協(xié)同及拮抗作用，以通過調(diào)控外泌體中多種miRNA的表達提高外泌體的治療作用。此外，在MSCs治療中，如何控制移植細胞量、選擇合適的移植區(qū)域和移植方式仍需要進一步探討，這些研究不僅有望大幅提高MSCs的治療效果，更有利于控制MSCs治療所面臨的潛在危險[16]。

[1]Prevention and management of osteoporosis[J]. World Health Organ Tech Rep Ser, 2003, 921: 1-164.

[2] Khan AA, Rios LP, Sándor GK, et al. Bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaw in Ontario: A survey of oral and maxillofacial surgeons[J]. J Rheumatol, 2011, 38(7): 1396-1402.

[3] 李光輝, 王茜, 居兆鈺, 等. 應(yīng)用外周血CD34+細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)細胞膜片修復(fù)兔顱骨缺損[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 29(6): 761-765.

[4] 孫津龍, 明磊國, 沈麗娟, 等. Bax channel blocker逆轉(zhuǎn)衰老骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)行為的研究[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 30(3): 311-316.

[5] Antebi B, Pelled G, Gazit D. Stem cell therapy for osteoporosis[J]. Curr Osteoporosis Rep, 2014, 12(1): 41-47.

[6] Liu S, Liu D, Chen C, et al. MSC transplantation improves osteopenia via epigenetic regulation of notch signaling in lupus[J]. Cell Metab, 2015, 22(4): 606-618.

[7] Sun L, Akiyama K, Zhang H, et al. Mesenchymal stem cell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupus erythematosus mice and humans[J]. Stem Cells, 2009, 27(6): 1421-1432.

[8] EL Andaloussi S, M?ger I, Breakefield XO, et al. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities[J]. Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(5): 347-357.

[9] Théry C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes: Composition, biogenesis and function[J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2(8): 569-579.

[10]Li Y, Fan L, Hu J, et al. MiR-26a rescues bone regeneration deficiency of mesenchymal stem cells derived from osteoporotic mice[J]. Mol Ther, 2015, 23(8): 1349-1357.

[11]Yang N, Wang G, Hu C, et al. Tumor necrosis factor alpha suppresses the mesenchymal stem cell osteogenesis promoter miR-21 in estrogen deficiency-induced osteoporosis[J]. J Bone Miner Res, 2013, 28(3): 559-573.

[12]Ostrowski M, Carmo NB, Krumeich S, et al. Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway[J]. Nat Cell Biol, 2010, 12(1): 19-30.

[13]Altman AM, Matthias N, Yan Y, et al. Dermal matrix as a carrier forinvivodelivery of human adipose-derived stem cells[J]. Biomaterials, 2008, 29(10): 1431-1442.

[14]Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, et al. Stem cell therapy for liver disease: Parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Gastroenterology, 2008, 134(7): 2111-2121, 2121, e1-3.

[15]Liu S, Jiang L, Li H, et al. Mesenchymal stem cells prevent hypertrophic scar formation via inflammatory regulation when undergoing apoptosis[J]. J Invest Dermatol, 2014, 134(10): 2648-2657.

[16]Herberts CA, Kwa MS, Hermsen HP. Risk factors in the development of stem cell therapy[J]. J Transl Med, 2011, 9: 29-29.

RescueofrecipientMSCfunctionsandremissionofrecipientosteoporosisbydonorMSC-derivedexosomesthroughtransferofmiR-26a

YEQingyuan,QIUXinyu,TIANRong,LIUShiyu.

710032Xi'an，StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&ShaanxiKeyLaboratoryofOralDiseases,DepartmentofOralHistologyandPathology,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity，China

Objective: To explore mechanisms underlying the rescuing effects of transplanted mesenchymal stem cells(MSCs) derived exosomes on estrogen-deficient osteoporosis.MethodsMouse estrogen-deficient osteoporosis model was constructed in 12 female C57BL6/J rats and the exosome release was regulated by siRNA. Osteogenic induction, alizarin red staining and qPCR were performed to evaluate the effects of exosomes on recipient MSC functions. The miR-26a mimics and inhibitors and qPCR were used to explore the mechanisms underlying exosome-mediated functional rescue of recipient MSCs.ResultsDonor MSCs alleviated estrogen-deficient osteoporosis via exosome release, and the alleviated osteoporosis by exosomes rescued the recipient MSC functions were observed. Moreover, the rescued recipient MSC functions by exosomes transferred miR-26a were found.ConclusionDonor MSC-derived exosomes may rescue MSC functions and may remit osteoporosis of the recipient through transfering miR-26a.

Mesenchymalstemcells(MSCs)；Osteoporosis；Exosomes

國家自然科學(xué)基金面上項目(編號： 31670995)

710032 西安, 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室， 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心， 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織病理學(xué)教研室[葉慶元(現(xiàn)就讀于第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅) 邱新毓 田榮 劉世宇]

劉世宇 E-mail: liushiyu123@126.com

R329

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.001

(收稿： 2017-05-08 修回： 2017-07-13)