程 倩，嵇樂樂，韓雪嬌，仲啟迪，辛 江，賈建波

(淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003)

瓜蔞皮抗腫瘤活性成分的初步研究

程 倩，嵇樂樂，韓雪嬌，仲啟迪，辛 江，賈建波*

(淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003)

采用改進的MTS法來探究瓜蔞皮石油醚相不同極性成分對結腸癌HCT-116細胞和乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用，探討其抗腫瘤活性。利用硅膠柱色譜制備極性不同的五種成分，改進的MTS法檢測細胞的增殖作用，Propidium Iodide染色法分析HCT-116細胞周期；Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116細胞凋亡。在低濃度情況下發(fā)現，瓜蔞皮醚相極性成分促進MCF-7細胞生長，成分E誘導細胞停滯在S-期而起到抑制癌細胞增殖的作用，并且成分C及E抗癌細胞增殖作用是通過誘導細胞凋亡介導的作用機制，并以劑量依賴方式誘導其細胞凋亡。通過硅膠柱色譜制備的石油醚相不同極性成分具有抗腫瘤活性。

瓜蔞皮；硅膠柱色譜；細胞系；抗腫瘤

0 引言

癌癥目前已經成為威脅人類健康的重大疑難疾病之一。由于缺乏有效的治療手段，因癌癥死亡的人數呈現逐年遞增的趨勢[1]。而中藥作為天然產物存在著廣泛的生物活性物質，因此近年來國內外抗腫瘤藥物的研究已逐漸轉向天然動植物，中醫(yī)藥治療腫瘤逐漸成為腫瘤治療領域的一個新途徑[2]。相比于西藥，中藥治療腫瘤具有多個作用靶點、多種治療效應、療效作用持久及不易復發(fā)等諸多優(yōu)勢[3]。其中栝樓屬植物抗腫瘤活性研究近幾年越來越受到國內外研究者的重視。瓜蔞皮的體外抗癌效果較瓜蔞仁強，子殼和脂肪油均無效，自瓜蔞皮醚浸出液中得到的類白色非晶體性粉末也有體外抗癌作用[4-5]。

瓜蔞皮為葫蘆科植物栝樓或雙邊栝樓的干燥成熟果皮[6]，屬于常用中藥，始載于《神農本草經》[7]，具有清熱滌痰、寬胸散結、潤燥滑腸等功效，用于治療痰濁黃稠、肺熱咳嗽、結胸痞滿、胸痹心痛、乳癰、常癰腫痛、肺癰、大便秘結等癥狀[8]?，F代藥理研究表明，瓜蔞皮的藥理作用主要包括對心臟、血管的保護作用[9]，抗血小板聚集的作用，降低血清膽固醇、血糖的作用[10]，促進免疫的作用，抗菌抗炎作用，抗腫瘤[11]的作用等。

為指導正確使用瓜蔞皮對腫瘤的治療，對瓜蔞皮的抗腫瘤作用做了初步研究。前期研究表明瓜蔞皮石油醚相具有抗腫瘤作用，本研究采用體外細胞培養(yǎng)法評價抗癌活性，選用人結腸癌細胞系HCT-116和人乳腺癌細胞系MCF-7為評價模型，通過MTS法[12]測定細胞活力、探索瓜蔞皮的抗癌活性，及瓜蔞皮活性成分與抗癌之間的關系。

1 實驗材料及儀器

1.1實驗原料與試劑

瓜蔞皮，購于江蘇淮安盱眙當地，50～55℃下烘干至質量恒定后粉碎過篩備用；結腸癌細胞系HCT-116，乳腺癌細胞系MCF-7，來源于ATCC細胞庫；McCoy’s 5A培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，購于上海中喬新舟生物科技公司；致死牛血清蛋白FBS，購于上海復蒙基因生物科技有限公司；200 ×青霉素-鏈霉素溶液，購于上海千曦生物科技有限公司；細胞增殖分析試劑盒，細胞凋亡檢測試劑盒，Propidium Iodide (PI)，RNase，購于上海吉滿生物科技有限公司；甲醇等試劑均為分析純。

1.2實驗儀器與設備

DJ-10A傾倒式破碎機，上海淀久中藥機械制造有限公司；B-220旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JY88-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；WH-3微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-3C精密酸度計，上海精密科學儀器公司；200～300目硅膠，青島海洋化工有限公司；FACScan流式細胞儀，上海曙誠醫(yī)療科技發(fā)展有限公司。

2 實驗方案

2.1瓜蔞皮石油醚相不同極性成分制備

準確稱取藥材0.5 kg，粉碎，過60目篩，用10倍體積的80%乙醇超聲破碎提取三次，將提取液于40℃旋轉蒸發(fā)濃縮，得瓜蔞皮浸膏103.47 g，溶于5倍體積的去離子水中，用等體積的石油醚萃取三次，收集石油醚相，減壓濃縮得到石油醚相浸膏18.29 g。用少量石油醚溶解后上硅膠柱色譜，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯=10:1，石油醚-乙酸乙酯=5:1，石油醚-乙酸乙酯=1:1，乙酸乙酯進行洗脫，得五種不同極性成分A、B、C、D、E。

2.2癌細胞的培養(yǎng)

結腸癌細胞系HCT-116和乳腺癌細胞系MCF-7 分別用McCoy’s 5A和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中均補加有10% FBS和50 units/mL的青霉素-鏈霉素混合液，細胞培育均在由5% CO2和95%空氣組成的潮濕空氣中，溫度控制在37℃。

2.3用改進的MTS法進行細胞增殖分析

細胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，24 h后，用含有不同濃度DMSO培養(yǎng)液更換培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，DMSO最終含量為0.5%。用0.5% DMSO作為空白對照，所有實驗均進行3次，參照廠家說明書，用MTS試劑盒評價細胞增殖，暴露處理結束后，在每一培養(yǎng)孔中用含有20 μL MTS 試劑的100 μL新鮮培養(yǎng)基替換，并放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，從每孔中取60 μL轉移至96孔ELSA板，于490 nm波長下記錄其吸光度。結果用相對空白對照的百分比計 (僅含0.5% DMSO的空白對照記為100%)。

2.4 Propidium Iodide染色法分析HCT-116細胞周期

為進一步評價瓜蔞皮不同極性成分A→E對抗癌潛力的影響，用不同濃度的成分A和E處理HCT-116細胞系。細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)板中，48 h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別含有不同濃度的成分A和E，再培養(yǎng)48 h后收獲細胞，用80%乙醇在蝸旋下溫和固定，置于冰柜中2 h，于冰浴上用0.25% Triton X-100 處理5 min，細胞懸浮于含有40 μg/mL PI和0.1 mg/mL RNase的300 μL PBS中，室溫下暗室培養(yǎng)20 min，用FACScan流式細胞儀分析測試細胞周期，并用FlowJo 10.0.4軟件 (Tree Star, Ashland, OR)進行數據分析，對每一次測量，至少計數20000個細胞。

2.5 Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116細胞凋亡

細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1天后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有不同濃度的A、C、E，培養(yǎng)48 h后收集懸浮細胞及粘壁細胞(用0.25%胰酶脫附后)，加入含有FBS培養(yǎng)基使胰酶失活，輕輕吹散后，在1500 r/min下離心5 min，吸除上清液，根據廠家說明用Annexin V-FITC 和PI試劑盒染色處理細胞。用未加藥處理的細胞雙染后作為空白對照。染色后，立即用FACScan流式細胞分析，每次測量中，至少計數20000個細胞。

3 結果

3.1五種不同極性成分對HCT-116及MCF-7的抗增殖作用

分析瓜蔞皮石油醚相五種不同極性成分對癌細胞生長抑制的影響，結果如圖1所示。

20 μg/mL濃度處理48 h，成分A抑制了8.1%的HCT-116細胞生長，而成分E抑制了83.8%的細胞生長，其它成分抗增殖潛力介于A和E之間。 瓜蔞皮石油醚相不同極性成分對MCF-7細胞的敏感性比HCT-116低。在100 μg/mL濃度下，成分A抑制了20.5% MCF-7細胞生長，而成分B、C、D、E分別抑制30.1%、55.4%、65.5%、87.6%。在低濃度情況下發(fā)現，瓜蔞皮醚相極性成分反而促進MCF-7細胞生長。而成分E對HCT-116及MCF-7細胞的IC50濃度分別為5 μg/mL與30 μg/mL。

圖1 不同極性成分對HCT-116及MCF-7癌細胞的濃度依賴的抗增殖作用

此外，還發(fā)現培養(yǎng)時間也影響醚相不同極性成分的抗癌細胞增殖效力。取10 μg/mL的五種極性成分分別處理HCT-116和MCF-7細胞24、48、72 h，結果如圖2所示，發(fā)現成分E對HCT-116細胞生長分別抑制了57%、61%、80%，對MCF-7細胞也有類似抑制效果并且以時間依賴方式抑制癌細胞增殖。此外，成分E對兩株癌細胞均呈現出最強抑制作用，這些結果顯示瓜蔞皮石油醚相經乙酸乙酯洗脫的成分E能夠顯著地增強其抗癌潛能。

圖2 不同極性成分對HCT-116及MCF-7癌細胞的時間依賴的抗增殖作用

3.2成分A和E對HCT-116細胞周期的影響

為了探討瓜蔞皮醚相經硅膠柱不同極性溶劑洗脫的成分抑制HCT-116細胞生長的潛在作用機制，運用流式細胞儀分析了細胞周期的輪廓，如圖3所示(三行圖依次為對照、A、E)。從圖中可以發(fā)現，相比較于對照，成分A未明顯改變細胞周期分布輪廓，而觀察到成分 E顯著改變細胞周期分布輪廓。在成分E濃度為1 μg/mL與2.5 μg/mL處理下不能改變細胞周期分布輪廓，但隨著濃度增大，細胞周期分布輪廓明顯被改變了。相較于對照(57.1% 細胞處于G-期、25.3%細胞處于S-期、19.9% 細胞處于G2/M-期)，10 μg/mL成分E處理48 h后G1-、S-、G2/M-期細胞百分比分別為33.1%、46.0%、15.6%；20 μg/mL成分E處理48 h后G1-、S-、G2/M-期細胞百分比分別為25.4%、52.1%、21.7%。結果顯示：成分E顯著誘導細胞停滯在S-期而起到抑制癌細胞增殖的作用。

圖3 不同濃度A及E對 HCT-116細胞周期的影響

圖4 不同濃度A、C、E對 HCT-116細胞凋亡作用的影響

3.3成分A、C及E對HCT-116細胞凋亡作用的影響

細胞增殖分析結果顯示不同極性成分抑制癌細胞增殖能力與處理細胞時間長短相關聯。為進一步探究不同極性成分的作用機制，進行了細胞凋亡分析實驗，結果如圖4所示(三行圖依次為A、C、E)。相較于對照 (早期凋亡細胞為4.7%～5.6%，晚期凋亡細胞為2.2%～3.6%)，用濃度5 μg/mL及10 μg/mL處理48 h后，成分A未增加早期和晚期凋亡細胞數，而成分C溫和地增加了早期凋亡細胞至17.6%，成分E快速增加了早期細胞凋亡至48.1%。同樣地，也觀測到成分C及E顯著增加了晚期凋亡。 結果表明成分C及E抗癌細胞增殖作用是通過誘導細胞凋亡介導的作用機制，并以劑量依賴方式誘導其細胞凋亡。進而，也顯示了凋亡誘導潛力與成分極性相關聯。

4 結論

本文較為系統(tǒng)地研究了通過硅膠柱色譜制備的瓜蔞皮石油醚相五種不同極性成分對結腸癌HCT-116和乳腺癌MCF-7細胞系的抗癌活性，得出以下結論：

在細胞抗增殖作用實驗中，五種成分對HCT-116 及MCF-7細胞有著明顯的抗增殖作用且以時間依賴方式抑制癌細胞增殖，其中成分E對HCT-116及MCF-7細胞的IC50濃度分別為5 μg/mL與30 μg/mL，并且發(fā)現低濃度的成分A反而促進MCF-7細胞生長；利用Propidium Iodide 染色法分析HCT-116細胞周期實驗中，其中成分E能夠顯著的誘導癌細胞停滯在S-期從而起到抑制癌細胞增殖的作用；而Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116細胞凋亡實驗中，成分C及E的抗癌細胞增殖作用是通過誘導細胞凋亡介導的作用機制，并以劑量依賴方式誘導其細胞凋亡。進而，也顯示了凋亡誘導潛力與成分對細胞處理時間長短相關聯，但其機制還有待進一步深入研究。

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APreliminaryStudyontheAntitumorConstituentsofPericarpiumTrichosanthis

CHENG Qian, JI Le-le, HAN Xue-jiao, ZHONG Qi-di, XIN Jiang, JIA Jian-bo*

(Faculty of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Techonology, Huai'an Jiangsu 223003, China)

Improved MTS method was used to explore the inhibitory effect of different polar components in human colon cancer HCT-116 cells and breast cancer MCF-7 cell proliferation gualoupi petroleum ether, and its antitumor activity was explored. Using silica gel column chromatography to prepare five different components with different polarity, the proliferation of MTS cells was detected. The improved method Propidium Iodide staining was used for the analysis of HCT-116 cell cycle. Analysis of apoptosis of HCT-116 cells was by Annexin V-FITC/Propidium Iodide staining. In the case of low concentration, gualoupi ether polar components promote the growth of MCF-7 cells. E components induce the cell cycle in S- phase to inhibit the proliferation of cancer cells; E cancer cell proliferation is through the mechanism of inducing apoptosis mediated, and inducing apoptosis in a dose dependent manner. The petroleum ether phase with different polar components prepared by silica gel column chromatography has antitumor activity.

Trichosanthes; silica gel column chromatography; cell line; antitumor

TQ461

A

1009-7961(2017)05-0036-05

2017-06-19

江蘇省研究生創(chuàng)新計劃基金項目(HGYK201603)

程倩(1989-)，女，江蘇宿遷人，在讀碩士，主要從事生物化工研究。*為通訊作者。

(責任編輯：鄭 菲)