劉助紅，王 靜，黃碧洪，尹雪琴，張 鈺，郭鵬舉，黃 韌

（廣東省實(shí)驗動物監(jiān)測所 廣東省實(shí)驗動物重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州510663）

猴免疫缺陷病毒實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法的建立

劉助紅，王 靜，黃碧洪，尹雪琴，張 鈺，郭鵬舉，黃 韌

（廣東省實(shí)驗動物監(jiān)測所 廣東省實(shí)驗動物重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州510663）

以猴免疫缺陷病毒（Simian immunode fi ciency virus，SIV）的核心蛋白Gag區(qū)域的部分保守基因序列為檢測靶標(biāo)，通過軟件設(shè)計內(nèi)、外引物和環(huán)引物，借助恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀建立SIV實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法（real-time loop-mediated isothermal amplification，Realamp），根據(jù)有無“S”型擴(kuò)增曲線判斷檢測結(jié)果。Realamp方法對含有猴免疫缺陷病毒目標(biāo)片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測靈敏度為300 copies/μL，對猴類的其他常見病原如猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒、猴B病毒等無非特異性擴(kuò)增。通過33份臨床樣本的檢測，Realamp檢出的陽性2例，qPCR檢出的陽性率為1例，兩種檢測方法的符合率為97%。本研究建立的Realamp檢測技術(shù)所需設(shè)備簡單、反應(yīng)效率快、檢測靈敏度高和特異性強(qiáng)，可用于偏遠(yuǎn)地區(qū)猴養(yǎng)殖單位相關(guān)病原的檢測。

猴免疫缺陷病毒；實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)；檢測

猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV），也稱為非洲綠猴病毒（African Green Monkey virus），屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病毒屬，是一種可影響至少33種非洲靈長目的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些靈長目動物中病毒株由于各種原因跨越了種間屏障而進(jìn)入人體，并最終成為HIV的兩個亞型[1,2]。因此，SIV感染的恒河猴模型是研究人類HIV感染機(jī)理、發(fā)病機(jī)制、藥物篩選及疫苗評價的理想模型[3-7]。但是，SIV作為逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染宿主后，其RNA往往整合在宿主CD4+細(xì)胞的染色體上，以前體DNA的形式存在，潛伏周期很長。因此，在構(gòu)建SIV模型時，如何徹底、有效排除SIV病原是我們需要考慮的問題。近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，非人靈長類實(shí)驗動物作為重要的研究載體，對該載體的需求一直在持續(xù)增加[8]。擴(kuò)大非人靈長類動物種群數(shù)量，獲得高質(zhì)量、純凈、穩(wěn)定的非人靈長類實(shí)驗動物已成為當(dāng)前我國科學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)展的迫切要求。雖然建立無特定病原體（specific pathogen free，SPF）非人靈長類種群的成本很高，然而一旦建立起SPF級動物核心群，即可為科學(xué)研究持續(xù)提供高質(zhì)量的非人靈長類實(shí)驗動物[9]。此外，由于SIV能夠跨種感染，為了保證從業(yè)人員的安全，也需要一種快速、準(zhǔn)確、可現(xiàn)場檢測的方法來對SIV病原進(jìn)行有效監(jiān)測。

Notomi等[10]2000年發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)。該方法主要依賴具有鏈置換活性的Bst聚合酶，通過針對靶基因序列上的6個特定區(qū)設(shè)計4條特異性的引物，在恒溫條件下對靶序列進(jìn)行高效擴(kuò)增。后來隨著環(huán)引物的引入，擴(kuò)增效率進(jìn)一步加強(qiáng)，半個小時內(nèi)可以完成整個反應(yīng)。LAMP 技術(shù)因其特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高、擴(kuò)增效率高及設(shè)備需求簡單而廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測、動物疫病檢測、臨床疾病的診斷及轉(zhuǎn)基因的檢測等[11-15]，本研究根據(jù)SIV核心蛋白Gag保守基因序列建立了實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（real-time RCR loop-mediated isothermal amplification，Realamp）檢測方法，可用于偏遠(yuǎn)地區(qū)對SIV的有效監(jiān)測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備與試劑 恒溫?zé)晒鈾z測儀（Deaou 308C）購自廣州迪澳生物科技有限公司；冷凍離心機(jī)（Micro 21R）購自美國Thermo Scientific公司；PCR擴(kuò)增儀（TGradient）購自德國Biometra公司；超微量分光光度計（Nanodrop 2000）購自美國Thermo Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)(BioradGelDoc XR)購自美國BIO-RAD公司；電泳儀（DYCP-32A）為北京六一儀器廠產(chǎn)品；移液器（0.5～10μL、10～100μL、100～1000μL）為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（6110A）、Premix ExTaq（Probe qPCR）（RR390Q）、Premix TaqTMHot Start Version（RR030Q），dNTP Mixture（10 mmol/L each）（4019）購自TaKaRa公司；TRIzol?試劑（15596026）購自美國Thermo Scientific公司；Bst 2.0 WarmStart? DNA Polymerase（M0538S）購自NEB公司；5 mol/L甜菜堿溶液（B0300）購自美國Sigma公司；5 mol/L SYTO-9（S34854）購自美國Thermo Scientific公司。

1.1.2 毒株 SIVmac251 病毒株由國外實(shí)驗室惠贈。

1.1.3 樣品 猴子的抗凝血樣本來自廣東省和四川省的猴養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登記的SIVmac251毒株gag基因（GenBank登錄號：KF051800.1）保守序列，應(yīng)用軟件設(shè)計Realamp引物（表1）。設(shè)計的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 RNA提取 采用Trizol法抽提 SIV、猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒總 RNA，最后溶解于60 μL DEPC 水中。所獲 RNA用于cDNA的合成。

1.2.3 cDNA合成 用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA。RNA 5 μL、oligodT(50 μmol/L) 1μL、dNTP(10 mmol/L) 1μL，加滅菌ddH2O至10μL，混勻后于65℃反應(yīng)5 min，冰浴2 min，離心后加入5×buffer 4μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5μL、PrimeScriptRTase(200 U/μL) 1μL，混勻離心后于50℃反應(yīng)60 min，最后于95℃放置5 min終止反應(yīng)。

表1 Realamp引物Table 1 Realamp primers

1.2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 以1.2.3中合成的cDNA為模板，采用Realamp的外引物SIVOF/SIVOB配制體系：2×Premix TaqTM12.5 μL、SIVOF(10 μmol/mL) 1.0 μL、SIVOB(10 μmol/mL)1.0 μL、cDNA5.0 μL，補(bǔ)滅菌ddH2O至25 μL。按如下PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性40 s，55℃退40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)擴(kuò)增35次，72℃ 終延伸5 min。擴(kuò)增完畢，電泳回收目標(biāo)條帶，與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至DH5α中，挑取陽性克隆進(jìn)行保存，同時放大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用于后續(xù)分析。

1.2.5 Realamp反應(yīng)體系 參考LAMP反應(yīng)相關(guān)文獻(xiàn)及Bst 2.0說明書，建立如下Realamp反應(yīng)體系：20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、50 mmol/L KCl、6 mmol/mL MgSO4、0.1% Tween? 20、Bst2.0 8 U、1.2 mmol/mL each dNTP Mixture、1.0 mol/L甜菜堿溶液、0.2 μmol/mL 的SIVOF和SIVOB引物、0.8 μmol/L 的SIVLF和SIVLB引物、1.6 μmol/L 的SIVIF和SIVIB引物、1 μmol/L SYTO-9，DNA 2.0 μL，補(bǔ)滅菌ddH2O至25 μL。

1.2.6 靈敏度檢測 將1.2.4中提取的質(zhì)粒定量至1 ng/μL，然后用水進(jìn)行10倍梯度稀釋，直至100 ag/μL，按照1.2.5中的反應(yīng)體系進(jìn)行Realamp反應(yīng)，驗證檢測的靈敏度。

1.2.7 特異性檢測 分別以猴D逆轉(zhuǎn)錄病毒，猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒、猴B病毒核酸為模板，按照1.2.5中的反應(yīng)體系進(jìn)行Realamp反應(yīng)，驗證檢測的特異性。

1.2.8 臨床樣本的Realamp和PCR檢測 采集臨床樣本33份，通過血液基因組DNA提取試劑盒對SIV前病毒DNA進(jìn)行提取，運(yùn)用研究建立的Realamp方法進(jìn)行檢測，同時采用Premix Ex Taq（Proke qPCR）試劑盒說明書進(jìn)行qPCR對比驗證，統(tǒng)計兩種不同檢測方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 通過Realamp外引物SIVOF/SIVOB對目標(biāo)片段的擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1，可見目標(biāo)片段，大小約250 bp。通過切膠回收后，轉(zhuǎn)化克隆至DH5α中，培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒濃度為44.5 ng/μL，按如下公式換算成拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL)=6×1023(copies/mol)×DNA濃度(g/μL)/質(zhì)量MW（g/mol），提取的質(zhì)粒相當(dāng)于1.35×1010copies/μL。

圖1 SIVOF/SIVOB擴(kuò)增目標(biāo)片段Fig.1 Ampli fi cation of target with SIVOF/SIVOB

2.2 靈敏度檢測結(jié)果 通過對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各個濃度進(jìn)行Realmap檢測，如圖2顯示，陽性反應(yīng)有完整的S型曲線，并且濃度高的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，出現(xiàn)S型曲線的時間更早，說明核酸濃度與出現(xiàn)S型曲線的時間有良好的線性關(guān)系，對于半定量的檢測有實(shí)際的意義。另外，引物對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測靈敏度可達(dá)到1 fg/μL，相當(dāng)于300 copies/μL的質(zhì)粒。

2.3 特異性檢測結(jié)果 除了SIVcDNA和質(zhì)粒DNA外，其他幾種逆轉(zhuǎn)錄病毒的模板均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，對應(yīng)擴(kuò)增曲線均為平緩直線，因此，該方法對于猴免疫缺陷病毒核酸的檢測是特異的（圖3）。

2.4 臨床樣本Realamp和qPCR檢測結(jié)果的比較 采用本研究建立的Realamp檢測方法，針對臨床收集的33份樣本進(jìn)行檢測，同時，采用qPCR方法進(jìn)行檢測。33份臨床樣本中，Realamp檢測出陽性樣本2份，陰性樣本29份，qPCR檢測出陽性樣本1份。與qPCR方法相比較，Realamp檢測方法的敏感性為100%，特異性為97%，兩種檢測方法的符合率為97%。

圖2 Realamp檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度Fig.2 The sensitivity of Realamp for standard plasmid

圖3 Realamp檢測方法特異性驗證Fig.3 Speci fi city of Realamp method

3 討論

SIV感染的恒河猴模型的構(gòu)建和研究為艾滋病防治工作提供了良好的技術(shù)平臺。目前，SIV是普通級猴類病原必須檢測的項目，但國家標(biāo)準(zhǔn)中采用的檢測方法還是傳統(tǒng)的ELISA或IFA，這些方法檢測靈敏度較低，同時操作起來非常繁瑣[16,17]。大規(guī)模猴場養(yǎng)殖數(shù)量往往成千上萬，當(dāng)樣本量大的時候，檢測工作效率就非常低。從喆等[18]、王靜等[19]針對SIV的保守序列建立了熒光定量PCR檢測方法，但該方法需要昂貴的設(shè)備，同時需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作和對檢測結(jié)果進(jìn)行解讀。

本研究建立的Realamp檢測方法可檢測到300 copies/μL，靈敏度高，與王靜建立的熒光定量qPCR的靈敏度相當(dāng)，這是普通PCR方法無法比擬的[20]。同時，Realamp檢測方法改變以往LAMP技術(shù)需要電泳判定結(jié)果的方法，通過往體系中加入染料對整個反應(yīng)過程可進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，而且根據(jù)已知濃度的陽性對照擴(kuò)增曲線，可對未知樣品中的病毒濃度進(jìn)行半定量分析。最重要的是，Realamp檢測方法擺脫了熒光定量PCR等昂貴儀器設(shè)備的限制，不需要電泳檢測，極大的提高了對病原的檢測效率，并減少樣本往專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)運(yùn)輸過程中的帶來的風(fēng)險，非常適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)猴場養(yǎng)殖人員及基層檢測單位的相關(guān)檢測人員對相關(guān)病原自我進(jìn)行檢測，降低被感染的風(fēng)險，保證實(shí)驗用猴的質(zhì)量。

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DEVELOPMENT OF A REAL-TIME LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION FOR RAPID DETECTION OF SIMIAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS

LIU Zhu-hong, WANG Jing, HUANG Bi-hong, YIN Xue-qin, ZHANG Yu, GUO Peng-ju, HUANG Ren

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663,China)

In order to develop a real-time loop-mediated isothermal application method for detection of Simian immunode fi ciency virus(SIV), the inner, outer and loop primers were designed based on the conserved DNA sequence of gag protein. With the help of isothermal ampli fi cation equipment, Realamp assay was conducted and test results were evaluated by the“S”curve. The sensitivity of Realamp assay was 300 copies/μL for plasmids containing partial sequence of SIV. No ampli fi cation was found for Simian type D retrovirus,Simian T lymphotropic virus and Monkey B virus. Among 33 clinical samples, two were detected positive with Realamp assay while one of these two samples positive with qPCR. The Realamp developed here may be applied to detect SIV for monkey breeding business.

Simian immunode fi ciency virus; real-time loop-mediated isothermal ampli fi cation(Realamp); detection

S852.659.3

A

1674-6422（2017）05-0037-05

2017-01-12

廣東省科技計劃項目（2016A040403059，2014A040401035，2014B070706006）；國家科技支撐計劃項目（2015BA I07B01）

劉助紅，男，碩士研究生，助理研究員，主要從事動物病原微生物的檢測及技術(shù)研究

黃韌，E-mail: hrlabking@126.com