艾 敏，史曉娜,2，苑純秀,3，趙小超，李玉梅,2，侯旖旎,2，馮新港

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞M1型極化

艾 敏1，史曉娜1,2，苑純秀1,3，趙小超1，李玉梅1,2，侯旖旎1,2，馮新港1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

通過分析日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1（Schistosoma japonicum high mobility group protein B1，SjHMGB1）刺激的巨噬細胞的表型相關分子的表達情況，研究SjHMGB1誘導巨噬細胞向M1型極化的功能。分別用LPS及IFN-γ和IL-4誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞成M1型和M2型作為陽性對照組，以SjHMGB1誘導的巨噬細胞為實驗組。分別利用Griess法、FCM、RTPCR和酶活性檢測巨噬細胞中iNOS、CD16/32、ArginaseⅠ、CD206等主要標志分子。結果與空白對照組相比，SjHMGB1刺激組和M1型陽性對照組巨噬細胞NO分泌顯著增加，精氨酸酶活性變化不顯著，M2型巨噬細胞呈現(xiàn)相反的表型。流式結果顯示SjHMGB1刺激組和M1型陽性對照組的巨噬細胞誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）和CD16/32表達上調，而CD206變化不明顯。RT-PCR結果顯示SjHMGB1蛋白刺激組和M1型陽性對照組的巨噬細胞iNOS表達上調，而arginaseⅠ和CD206變化不明顯；M2型巨噬細胞arginaseⅠ表達水平明顯升高，CD206表達上調。結果表明SjHMGB1能夠誘導巨噬細胞往M1型巨噬細胞分化。

SjHMGB1蛋白；M1型巨噬細胞；精氨酸酶；誘導型一氧化氮合成酶

日本血吸蟲病是一種人畜共患寄生蟲病，在我國主要流行于長江流域和洞庭湖、鄱陽湖等湖區(qū)，截止2015年底仍有二十多萬人受到血吸蟲病的困擾[1]。目前吡喹酮化療在血吸蟲病防治中具有重要作用，但長時間使用吡喹酮導致耐藥蟲株的產生越來越引起人們的關注和憂慮[2]。因此，開發(fā)安全高效的抗血吸蟲疫苗來控制血吸蟲病顯得尤為急迫[3]。研究人員基于輻照致弱（radiation-attenuated，RA）疫苗保護性免疫的有效機制，提出了抗血吸蟲病分子疫苗的研制思路。RA血吸蟲尾蚴免疫小鼠后，在肺部誘導了以CD4+T細胞介導的Th1型為主的高保護性免疫應答，其中來源于T細胞和巨噬細胞的IFN-γ和TNF-ɑ等炎性因子發(fā)揮了重要的效應功能[4,5]，但是這種免疫微環(huán)境的形成和作用機制仍然不清楚。中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室（以下簡稱“本實驗室”）的初步研究表明，日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1（Schistosoma japonicum high mobility group protein B1，SjHMGB1）作為一類蟲源性的應激分子，可能在RA血吸蟲童蟲誘導的保護性免疫中起到重要作用，其機制可能是通過其刺激宿主免疫細胞，形成Th1型極化的先天免疫微環(huán)境，進而參與免疫調節(jié)，發(fā)揮免疫保護作用[6]。

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種染色質相關的核蛋白，也是細胞外損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）分子，是細胞死亡和存活的關鍵調節(jié)組分[7]。當機體組織損傷時釋放內源性危險信號，HMGB1非特異性地與DNA結合，可通過核孔穿梭于胞核和胞漿，遇到危險刺激時釋放到細胞外發(fā)揮作用[8]。研究表明，HMGB1是一種能夠介導感染、損傷和炎癥反應的細胞因子[9]，可參與炎癥反應的全身性應答和局部反應[10]。曼氏血吸蟲來源的HMGB1（SmHMGB1）通過誘導宿主巨噬細胞釋放大量的TNF-ɑ、IL-6、IL-13等炎性細胞因子，在宿主血吸蟲相關炎癥反應中起關鍵作用[11]；與此同時，磷酸化的SmHMGB1也可調節(jié)細胞運輸與分泌[12]。反過來，活化的單核細胞和巨噬細胞能夠分泌HMGB1[13]，也能通過自身耗竭間接減少炎癥，調節(jié)趨化因子產物，招募效應T細胞到肺，最終形成肺部炎性反應環(huán)境[14]。本實驗室李丹丹等[6]發(fā)現(xiàn)SjHMGB1能夠通過TLR2/TLR4途徑活化巨噬細胞，釋放TNF-ɑ、IL-1β等炎性細胞因子。

本研究用小鼠RAW264.7巨噬細胞系為模型，通過分析SjHMGB1刺激的巨噬細胞表型相關分子的表達情況，研究SjHMGB1是否具有誘導巨噬細胞向M1型極化的功能，旨在為深入研究RA血吸蟲童蟲誘導的保護性免疫的細胞核分子機制提供有力的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 RAW264.7小鼠巨噬細胞株由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室保存。

1.1.2 蛋白 SjHMGB1蛋白由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室構建保存的桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)所表達[15]。

1.1.3 主要試劑 細胞培養(yǎng)基DMEM（Gibco，11995-065）、胎牛血清（Gibco，10099-141）、TRYPSIN 0.25% EDTA（Gibco，25200072）、小鼠重組IFN-γ（Peprotech）、IL-4（Peprotech）等購自上海達科為生物科技有限公司；LPS（Sigma）購自上海少辛生物科技有限公司；TRIZOL REAGENT（Ambion，15596018）購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；DEPC水（Solarbio）；NO檢測試劑盒為碧云天公司產品；QuantiChromTMArginase Assay Kit (BioAssay Systems, DARG-200)試劑盒購自北京蘭博利德商貿有限公司；SYBR? Premix ExTaq（TaKaRa，RR420A）、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，RR047A）等購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；FITC標記的大鼠抗小鼠CD206（BD Pharmingen）、PE/Cy7標記的大鼠抗小鼠CD16/32（BD Pharmingen）、PE標記的兔抗小鼠iNOS（CST）等購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；其他試劑為進口或國產分析純。

1.1.4 引物 由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7巨噬細胞系的傳代培養(yǎng)及體外刺激 RAW264.7巨噬細胞系用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃ 5%CO2的生化培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。該細胞是貼壁細胞，先用PBS洗去培養(yǎng)基，再加入2 mL、TRYPSIN 0.25% EDTA/5 mL DMEM消化25～30 min后，用PBS洗去胰酶，最后用完全培養(yǎng)基脫落細胞，48 h傳代1次。收集成熟的巨噬細胞，將細胞濃度調成2×106cells/mL，2×106cells/孔鋪于24孔板，以IFN-γ（100 U/mL）和LPS（200 ng/mL）共同刺激培養(yǎng)24～48 h，誘導M1型巨噬細胞；以IL-4（10 ng/mL）刺激培養(yǎng)24～48 h誘導M2型巨噬細胞；SjHMGB1 50 μg/mL刺激培養(yǎng)24～48 h，同時以100 μL PBS為空白對照組。

1.2.2 誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性檢測 收集上述培養(yǎng)24 h的細胞上清，按照說明書要求取50 μL標準品和樣品加入96孔板中，每孔加入50 μL Griess R1室溫避光放置5 min；再每孔加入50 μL的Griess R2室溫避光放置5 min；540 nm測定吸光度。制備標準曲線并計算NO的濃度。

1.2.3 精氨酸酶（ArginaseⅠ）活性檢測 收集刺激培養(yǎng)48 h的細胞，PBS洗1次，4℃、1000×g離心10 min，使用100 μL 10 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）含1μmol/L pepstatin A、1μmol/L leupeptin和0.4%（w/v）TritonX-100裂解10 min，RT；4℃、14 000×g離心10 min，收集上清，用于ArginaseⅠ活性檢測。設置1 mmol/L Urea standard和ddH2O組各50 μL/孔，按照試劑盒使用說明書進行檢測。樣品組（添加arginine底物）和空白對照組（未添加arginine底物）組，37℃孵育2 h，加入200 μL Urea Reagent A和B（1:1，V/V）混合終止反應，空白對照組再加入10 μL arginine底物，RT孵育60 min，430 nm處測定吸光度。

1.2.4 流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞膜蛋白CD206、CD16/32和膜內蛋白iNOS的表達 刺激培養(yǎng)巨噬細胞24 h后，收集細胞，4℃、1000×g離心5 min，細胞用200 μL 含2%BSA的PBS懸起，加入FITC-CD206、PE/Cy7-CD16/32，4℃染色30 min；用含2%BSA的PBS洗1次，4%多聚甲醛室溫固定20 min；含2%BSA的PBS洗1次，加入100 μL 0.1%皂素（含1%BSA、0.1%NaN3、0.1%saponin的PBS）室溫破膜10 min；再加入PE-iNOS染色30 min（4℃）；用預冷的PBS洗1次，400 μL PBS懸起細胞轉至流式管，流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 總RNA的抽提及RT-PCR

1.2.5.1 總RNA的抽提 巨噬細胞刺激培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)上清全部棄去，PBS洗滌細胞1遍，棄去所有液體，每2×106cells加入500 μL TRIzol，脫落細胞收集至無RNase的1.5 mL EP管內，充分震蕩裂解細胞，另加200 μL氯仿，混勻成乳狀，冰上靜置3 min，出現(xiàn)上下分層現(xiàn)象；4℃、12 000×g離心15 min，液體分成3層，從上到下依次是透明澄清液體、白色層、紅色層，收集透明液體于新的EP管中，加入600 μL的異丙醇，劇烈混勻，于-80℃放置24 h后取出。冰上溶解后加入DEPC水配制的75%乙醇（V/V）沖洗RNA，輕柔渦旋，4℃、7500×g離心5 min，吸去所有上清，保留沉淀，空氣中傾斜干燥5 min，加入10 μL RNase free water 55℃水浴鍋溶解1 min，檢測RNA濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 RT-PCR 基因組DNA的去除：將RNA稀釋成500 ng/μL，各試劑添加比例及條件如下，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、Total RNA 2μL、RNase Free dH2O補足至10 μL，42℃ 2 min，4℃?zhèn)溆?；反轉錄反應體系：5×PrimeScript? Buffer 2（for Real Time） 4 μL、PrimeScript? RT Enzyme MixI 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、反應液10 μL、RNase free water 補足至20 μL，輕柔混勻后進行反轉錄反應；反應條件：37℃15 min；85℃ 5 s，4℃。按照SYBR? Premix Ex Taq說明書使用ABI7500 real-time PCR system進行如下反應：95℃預變性2 min；95℃預變性15 s和60℃退火1 min，40個循環(huán)。添加擴增產物的溶解曲線來確定反應的特異性。利用2-△△CT法計算目的基因mRNA的相對表達。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism5.0、ABI7500Software v2.0.1或FlowJo7.6.2軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間差異比較采用Student’s t檢驗，P<0.05視為差異具有顯著性統(tǒng)計學意義，P<0.01視為差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SjHMGB1蛋白對巨噬細胞分泌NO的影響 以Griess法檢測RAW264.7巨噬細胞分泌到上清中的NO含量，由圖1可以看出，LPS和SjHMGB1的刺激能夠促使巨噬細胞分泌NO，且SjHMGB1刺激組的含量與對照組差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）。表明SjHMGB1蛋白可以刺激巨噬細胞釋放大量NO，說明此時巨噬細胞精氨酸代謝主要是iNOS途徑。

2.2 巨噬細胞精氨酸酶（ArginaseⅠ）活性的變化 在體外培養(yǎng)條件下，參照經典方法以IFN-γ及LPS將RAW264.7巨噬細胞誘導成M1型巨噬細胞，以IL-4將其誘導成M2型巨噬細胞。結果發(fā)現(xiàn)，SjHMGB1蛋白刺激組的巨噬細胞精氨酸酶活性較空白對照組稍有上升，對比LPS+IFN-γ組幾乎沒有變化，對比IL-4組明顯降低，說明SjHMGB1蛋白不能誘導M2型巨噬細胞合成量增加，此時精氨酸酶途徑不占主導地位（圖2）。

圖1 重組SjHMGB1蛋白刺激巨噬細胞NO釋放Fig.1 The release of NO from Macrophage stimulated by rSjHMGB1

圖2 重組SjHMGB1蛋白刺激巨噬細胞的精氨酸酶活性Fig.2 ArginaseⅠ activity of macrophage stimulated by rSjHMGB1

2.3 流式細胞術（FCM）檢測細胞膜蛋白CD206、CD16/32和膜內蛋白iNOS 的表達 巨噬細胞膜蛋白表達的差異是鑒定不同類型巨噬細胞的重要方法。應用FCM對M1型巨噬細胞的標志CD16/32（FcγIII/FcγII receptor）、iNOS（inducible nitric oxide synthase）和M2型巨噬細胞的標志CD206（mannose receptor）的表達進行檢測。結果表明，SjHMGB1和LPS刺激組CD16/32、iNOS較對照組有明顯上升，而CD206沒有明顯變化（圖3）。說明SjHMGB1蛋白可誘導膜表面分子CD16/32和膜內分子iNOS表達量上升，而不能誘導CD206表達增加，該蛋白刺激可使巨噬細胞向M1型分化。

圖3 流式細胞術檢測巨噬細胞CD16/32、iNOS和CD206的表達Fig. 3 The expression of CD16 / 32, iNOS and CD206 in macrophages detected by fl ow cytometry

2.4 巨噬細胞表面標志及細胞因子的相對表達 為檢測在LPS+IFN-γ、IL-4以及SjHMGB1蛋白刺激下，巨噬細胞表達標志分子iNOS、CD206和ArginaseⅠ的情況。利用RT-PCR技術檢測3種刺激物及空白對照組處理下，3種標志分子的mRNA的轉錄水平如圖4所示。結果表明，與空白對照組相比，SjHMGB1蛋白刺激組和LPS刺激組的巨噬細胞iNOS的mRNA轉錄水平顯著提高，而CD206和ArginaseⅠ的mRNA水平沒有明顯提高，進一步說明了SjHMGB1可能誘導巨噬細胞向M1型分化。

圖4 RT-PCR分析巨噬細胞相關標志分子iNOS、CD206 和ArginaseⅠFig. 4 Analysis of macrophage - associated markers including iNOS, CD206 and ArginaseⅠby RT – PCR

3 討論

近年來的研究表明，輻照和某些藥物可以使腫瘤細胞產生免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD），與此同時這些細胞會分泌或釋放一些損傷相關分子模式（DAMPs），如HMGB1、熱休克蛋白( heat shock proteins，HSPs）和ATP等，這些DAMPs分子具有免疫刺激功能，從而可以激活宿主的抗腫瘤免疫應答[16]。本課題組前期研究也提示，輻照血吸蟲來源的細胞也可能具有ICD的特征，能夠分泌或釋放DAMPs分子，如SjHMGB1和SjHSP70等可分泌至細胞表面或胞外，活化小鼠巨噬細胞或樹突狀細胞[17]。因此，研究RA血吸蟲尾蚴或童蟲來源的SjHMGB1和SjHSP70等分子誘導巨噬細胞向致炎性的M1型方向極化的分子機理，可闡明輻照血吸蟲尾蚴或童蟲誘生的Th1極化的微環(huán)境的形成機制。

小鼠RAW264.7巨噬細胞系是用于研究固有免疫的常用細胞模型，在不同抗原的刺激下巨噬細胞可以分化為不同的表型（M1型和M2型）[6]。M1型主要被LPS、TNF-α、IFN-γ等細胞因子激活，表現(xiàn)為促進炎癥反應；而M2型分別由IL-4或IL-13誘導成M2a型表現(xiàn)為損傷修復，由TLRs和免疫復合物誘導成M2b型表現(xiàn)免疫調節(jié)功能，由IL-10誘導成M2c表現(xiàn)免疫抑制效應。M1型主要標志分子及細胞因子有iNOS、CD16/32、TNF-ɑ、IL-6、IL-1β等，IL-12表達上調，IL-10表達下調；M2型主要標志分子及細胞因子有Arg-1、CD206、CD163、VEGF、TGF-β等，IL-12表達下調，IL-10表達上調[18]。因此，本文通過測定SjHMGB1刺激的巨噬細胞表型標志分子，初步提示該蛋白能夠誘導巨噬細胞M1極化。本實驗室李丹丹等[6]發(fā)現(xiàn)SjHMGB1蛋白刺激后，巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7表達明顯上調，具有致炎性M1型巨噬細胞的功能。至于巨噬細胞M1極化后，微環(huán)境中細胞因子變化，還需要進一步驗證。

正常情況下，iNOS與ArginaseⅠ的表達和活性在巨噬細胞中受到嚴格調控，兩者的動態(tài)平衡在維持巨噬細胞的功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[19]。ArginaseⅠ能夠代謝精氨酸，產生鳥氨酸、尿素等；而一氧化氮合酶（iNOS或NOS）則將其代謝產生瓜氨酸和NO，瓜氨酸再為精氨酸的合成所利用，NO作為第二信使利用或釋放[20]。有研究顯示，巨噬細胞產生的NO可以參與殺滅肺期血吸蟲童蟲[21,22]；ArginaseⅠ高表達的M2型巨噬細胞可導致小鼠發(fā)生肺實變和纖維化[23]。本研究通過檢測NO含量來代表相關酶的活性，可進一步分析巨噬細胞分化方向。本研究中我們主要采用測定巨噬細胞的表型標志分子的方法，來初步鑒定小鼠巨噬細胞在SjHMGB1刺激下是否會向M1型方向極化，為深入研究RA血吸蟲尾蚴或童蟲保護性免疫的分子機制提供資料。至于RA SjHMGB1是否也通過刺激巨噬細胞產生NO參與殺滅肺期血吸蟲童蟲，還需要進一步驗證。

本文檢測到小鼠巨噬細胞在經過SjHMGB1刺激后，與M1型相關的表型標志分子的表達都明顯上調，這與用IFN-γ及脂多糖（LPS）誘導產生的M1型巨噬細胞的相應的表型標準分子的表達圖譜類似。實驗數(shù)據(jù)充分表明SjHMGB1具有類似于致炎性細胞因子的功能，能夠誘導巨噬細胞往M1型巨噬細胞分化，這一結果很可能與輻照血吸蟲誘生的Th1極化的微環(huán)境的形成密切相關。因此，SjHMGB1很可能是一個重要的免疫刺激分子，在RA血吸蟲尾蚴或童蟲誘導的高保護性免疫中發(fā)揮重要的作用。

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M1 TYPE POLARIZATION OF MURINE RAW264.7 MACROPHAGES INDUCED BY HIGH MOBILITY GROUP PROTEIN B1 OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

AI Min1, SHI Xiao-na1,2, YUAN Chun-xiu1,3, ZHAO Xiao-chao1, LI Yu-mei1,2, HOU Yi-ni1,2,FENG Xin-gang1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The role of Schistosoma japonicum high mobility group protein B1 (SjHMGB1) in the induction of macrophages to M1 type polarization was investigated through the analysis of expression of phenotype-related molecules on stimulated macrophages. The mouse RAW264.7 macrophages induced by LPS and IFN-γ or IL-4 respectively to M1 or M2 type were set as positive control groups. Griess,FCM, RT-PCR and enzyme activities were analyzed to detect the expression of major marker molecules including iNOS, CD16/32,arginaseⅠand CD206 in macrophages. As compared with the positive control groups, a few changes were observed, including signi fi cant increase of the NO secretion of macrophages in SjHMGB1 treatment group and M1 group, slight increase in the activity of arginaseⅠand opposite phenotype of M2 type macrophages. In addition, fl ow cytometry analysis showed signi fi cant up-regulation of the expression of iNOS and CD16/32 of macrophages in SjHMGB1 group and M1 group except CD206. RT-PCR results also indicated up-regulated expression of iNOS in SjHMGB1 group and M1 group as well as CD206 and enzyme activities of M2 macrophages. However, the expression level and arginase I did not change signi fi cantly. In conclusion, SjHMGB1 induced the differentiation of macrophages into M1 type polarization.

Schistosoma japonicum high mobility group protein B1; M1 type macrophage; arginaseⅠ; iNOS

S852.735

A

1674-6422（2017）05-0053-07

2017-03-02

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2015CB150303）

艾敏，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

馮新港，E-mail：fengxingang@shuri.ac.cn