余建國，周 立

（浙江省金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，金華 321007）

·簡報(bào)·

姜黃素對豬圓環(huán)病毒滅活苗細(xì)胞免疫效果的影響

余建國，周 立

（浙江省金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，金華 321007）

為評價(jià)姜黃素對豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）滅活疫苗在仔豬免疫效果中的作用，將60頭三元雜交仔豬隨機(jī)平均分成3組，Ⅰ組于14日齡注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素0.5 mL，Ⅱ組于14日齡注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素1 mL，對照組于14日齡接種PCV2滅活疫苗1頭份。結(jié)果顯示，Ⅰ組和Ⅱ組仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，外周血NK細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。結(jié)果表明PCV2滅活疫苗與姜黃素聯(lián)合應(yīng)用，可提高仔豬對PCV2的細(xì)胞免疫水平，且在一定劑量范圍內(nèi)，姜黃素濃度增加有利于免疫活性的增強(qiáng)。

姜黃素；PCV2；滅活疫苗；細(xì)胞免疫；仔豬

豬圓環(huán)病毒病是當(dāng)前一種重要的豬傳染病，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）滅活疫苗有較好的安全性和免疫保護(hù)效力[1]，但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，PCV2滅活疫苗免疫后存在空白期比較長，免疫保護(hù)期比較短等缺點(diǎn)。

姜黃素是一種黃色素，從姜黃中提取，多用于食品著色，是一種常用的天然色素。諸多研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗人免疫缺陷病毒等作用[2]，且副作用極小，藥源穩(wěn)定，提取便利，在臨床上得到廣泛的使用。安全性評估研究表明姜黃素具有較好的耐受性，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的新藥。

目前，國內(nèi)外對姜黃素的研究主要集中于藥物代謝動力學(xué)以及抗腫瘤、抗炎和抗病毒效應(yīng)，而對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)研究較為少見，關(guān)于免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制更是鮮見報(bào)道。姜黃素對自由基的清除作用和誘導(dǎo)凋亡的作用都提示它存在免疫調(diào)節(jié)的潛力。具有鄰二羥基基因的姜黃素在抗氧化過程中，會產(chǎn)生穩(wěn)定性很好的醌類物質(zhì)，使其成為抗氧化物質(zhì)的冠軍。姜黃素具有較強(qiáng)的抗自由基，抗脂質(zhì)過氧化和穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用，可抑制氧自由基的產(chǎn)生，增加谷胱甘肽的水平，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體組織器官免受侵害[3]。有研究表明，姜黃素能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，刺激B細(xì)胞增殖、分化和免疫球蛋白產(chǎn)生，促進(jìn)T細(xì)胞生長[4]。本試驗(yàn)將中藥姜黃素與豬PCV2滅活疫苗聯(lián)合應(yīng)用，研究其對仔豬細(xì)胞免疫效果的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與儀器 姜黃素溶液（1 g/mL滅菌懸液）由安吉豐牧獸藥公司提供(中試液）；PCV2滅活疫苗（WH株）購自中牧股份有限公司（150918）；豬圓環(huán)病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒購自杭州康嘉動物營養(yǎng)科技公司；Uritest－3000型全自動血細(xì)胞分析儀為優(yōu)利特集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)豬的選擇與分組 選用溫嶺市某豬場提供的遺傳背景相近、經(jīng)ELISA檢測PCV2抗體一致（P＞0.05）的14日齡“杜洛克×（長白×大約克）”三元雜交健康仔豬60頭，隨機(jī)分為3組。常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水。Ⅰ組于14日齡頸部肌肉注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素0.5 mL混合液；Ⅱ組于14日齡頸部肌肉注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素1 mL 混合液；對照組于14日齡頸部肌肉接種PCV2滅活疫苗1頭份+1 mL生理鹽水混合液。

1.3 樣品的采集 免疫后d21、35、49，分別從各組隨機(jī)選取5頭仔豬，每頭仔豬采集靜脈血液2份。其中，1份2 mL肝素鈉抗凝，用于血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；1份EDTA-K2抗凝血1 mL，用于血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定 參照文獻(xiàn)[5]，采用四甲基偶氮唑鹽法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。

1.4.2 NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn) 采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定法。免疫后d21、35、49，分別從各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取3頭仔豬，處死后無菌取脾臟，進(jìn)行研磨，制成單個細(xì)胞懸液；離心，棄上清，將細(xì)胞加入0.5 mL滅菌水20 s，裂解紅細(xì)胞后加入0.5 mL的2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液；離心，將細(xì)胞懸浮于1640培養(yǎng)液中，用1%冰醋酸稀釋，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL。實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞（YAC - 1細(xì)胞）傳代培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。取YAC-1細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL加入96孔培養(yǎng)板，YAC-1細(xì)胞自然釋放孔加YAC-1細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，YAC-1細(xì)胞最大釋放孔加YAC-1細(xì)胞和1%1640各100 μL，均設(shè)3個重復(fù)[6]。5%CO2條件下37℃孵箱培養(yǎng)4 h，離心，取上清100 μL。置于96孔培養(yǎng)板，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)5 min，每孔加入1 mol/L的HCl30 μL，酶標(biāo)儀于490 nm處檢測光密度值，取3個數(shù)平均值。

1.4.3 外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的測定 采用全自動血細(xì)胞分析儀（Uritest－3000）測定對外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和LDS多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 姜黃素對仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響 采用MTT法測定血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，I組和II組不同日齡仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ⅱ組不同日齡仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均高于試驗(yàn)Ⅰ組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。結(jié)果表明，姜黃素與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能顯著提高細(xì)胞免疫活性，且在一定劑量范圍內(nèi)，隨姜黃素濃度增加而增強(qiáng)。可見，PCV2滅活疫苗加入外源性姜黃素，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)上升，明顯提高血液中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，有效促進(jìn)仔豬的細(xì)胞免疫功能，這與金光明等[7]研究結(jié)果相一致。

姜黃素在體外能直接促進(jìn)或協(xié)同細(xì)胞表達(dá)的凝集素ConA，促進(jìn)仔豬脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，加速細(xì)胞免疫機(jī)能的完成[8]，從而加強(qiáng)對外界刺激的免疫應(yīng)答。姜黃素能提高T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，且與劑量有關(guān)，推測該機(jī)制與抑制免疫細(xì)胞NF-κB的活化有關(guān)。

表1 姜黃素對仔豬血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響Table 1 Effect of curcumin on lymphocyte transformation rate of piglets

2.2 姜黃素對仔豬NK細(xì)胞活性的影響 采用LDH法測定血NK細(xì)胞活性，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組不同日齡NK細(xì)胞活性均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅱ組不同日NK細(xì)胞活性均高于Ⅰ組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2），表明姜黃素與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能顯著提高NK細(xì)胞免疫活性，且在一定劑量范圍內(nèi)，隨姜黃素濃度增加而增強(qiáng)。

結(jié)果提示，姜黃素能通過持續(xù)增強(qiáng)仔豬NK細(xì)胞的活性，表現(xiàn)出一定的免疫增強(qiáng)作用?；罨腘K細(xì)胞可以合成和分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮和調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺死靶細(xì)胞作用。加入姜黃素后，NK細(xì)胞活性明顯提高，原因可能是姜黃素具有較強(qiáng)的抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化和穩(wěn)定細(xì)胞膜作用, 并可抑制黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶的轉(zhuǎn)化，從而抑制氧自由基產(chǎn)生，增加谷胱甘肽的水平，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體組織器官免受侵害[9,10]。

表2 姜黃素對仔豬NK細(xì)胞活性的影響(±s)Table 2 Effect of curcumin on NK cell activity of piglets

表2 姜黃素對仔豬NK細(xì)胞活性的影響(±s)Table 2 Effect of curcumin on NK cell activity of piglets

注: 同列標(biāo)有不同小寫字母者表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 標(biāo)有不同大寫字母者差異極顯著(P＜0.01)，標(biāo)有相同字母者表示差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)Note: The values with different superscripts letter in the same column indicated there were signi fi cant difference between groups(P＜0.05), with the same superscripts capital letter indicated insigni fi cant difference(P＞0.05)

天數(shù)Days組別Group NK細(xì)胞活性NK cell activity（%）21試驗(yàn)Ⅱ組67.25±10.58a試驗(yàn)Ⅰ組58.25±13.33b對照組48.53±9.87c 35試驗(yàn)Ⅱ組76.95±14.13a試驗(yàn)Ⅰ組64.78±13.42b對照組49.64±12.62c 49試驗(yàn)Ⅱ組83.67±8.57a試驗(yàn)Ⅰ組74.24±13.64b對照組65.73±6.89c

2.3 姜黃素對仔豬外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響 采用全自動血細(xì)胞分析儀對外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，首免后21 d和35 d試驗(yàn)組外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量高于對照組和空白組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），首免后35 d對照組外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量高于空白組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量有上升的趨勢，但差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1），表明姜黃素與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫比單獨(dú)使用PCV2滅活疫苗免疫能增加外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。

血細(xì)胞是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的主要成分[11,12]，本研究中，實(shí)驗(yàn)組比對照組仔豬外周血紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量有所上升，外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，這在一定程度上說明姜黃素對仔豬的血紅蛋白合成、造血功能的提高有促進(jìn)作用，有利于提高機(jī)體非特異性免疫力和清除體內(nèi)的病原微生物，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。

圖1 姜黃素對仔豬外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響Fig.1 Effects of curcumin on peripheral blood cell differential counts of piglets

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ENHANCEMENT OF CURCUMIN ON IMMUNE RESPONSE OF INACTIVATED PORCINE CIRCONVIRUS TYPE 2 VACCINE IN PIGS

YU Jian-guo, ZHOU Li

(Jinhua Polytechnic, Zhejiang Province, Jinhua 321007, China)

The purpose of this experiment was to evaluate the enhancement effect of curcumin on inactivated Porcine circovirus type 2(PCV2) vaccine. Sixty piglets were randomly divided into 3 groups, 20 pigs each and immunized at 14-days old. The piglets in group 1 were injected with one dose of PCV2 vaccine plus 0.5 mL curcumin liquid, group 2 with one dose of PCV2 vaccine plus 1 mL curcumin liquid and group 3 with one dose of PCV2 vaccine only. Blood samples were collected and lymphocyte transformation was examined. The results showed signi fi cantly higher lymphocyte transformation in curcumin groups 1 and 2 than non-curcumin control group as evaluated from lymphocyte and NK cell counts.

Curcumin; PCV2; inactivated vaccine; cellular immunity; piglets

R282.710.5

B

1674-6422（2017）05-0060-04

2016-08-16

浙江省公益科技項(xiàng)目（2011c22093）

余建國，男，副教授，主要從事動物傳染病及免疫教學(xué)科研工作

余建國，E-mail：yjg-74@163.com