吳思敏，王釗哲，許 瑞，林矯矯，洪 煬，陳兆國，陸 珂，李 浩，石耀軍，江嘉欣，李嘉靜，朱傳剛，唐亞蘭

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室，上海200241；2. 韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，韶關(guān)512000）

豬瘟病毒表面抗原E2基因的克隆與原核表達(dá)

吳思敏1,2，王釗哲1，許 瑞1，林矯矯1，洪 煬1，陳兆國1，陸 珂1，李 浩1，石耀軍1，江嘉欣1,2，李嘉靜1,2，朱傳剛1，唐亞蘭1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室，上海200241；2. 韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，韶關(guān)512000）

為獲得可用于診斷的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E2蛋白重組抗原，對CSFV-E2的多個B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行重構(gòu)和表達(dá)。將人工合成的E2蛋白多抗原表位基因與pET-28a(+)載體連接后，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析蛋白可溶性，His親和層析柱純化蛋白并進(jìn)行抗原性檢測。重構(gòu)后的豬瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小約500 bp，PCR、雙酶切鑒定結(jié)果顯示與預(yù)期相符；重組蛋白為可溶性表達(dá)，大小約23 kDa； Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白可與豬瘟陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性，可作為診斷抗原用于豬瘟病毒感染動物的血清抗體檢測。

豬瘟病毒；E2基因；原核表達(dá)；蛋白純化

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）是一類具有包膜的小型RNA病毒，屬于黃病毒科，瘟病毒屬[1]。豬瘟是一種高度傳染性疾病，后期常伴有傷寒及巴氏桿菌病繼發(fā)，一年四季都有發(fā)生，以春夏多雨季為多。因其高傳染性給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，長久以來一直是養(yǎng)豬業(yè)的重要威脅[2]。

CSFV編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，此多聚蛋白經(jīng)病毒和宿主細(xì)胞酶的作用，形成4個成熟的結(jié)構(gòu)蛋白（C、Ems、El和E2）以及至少7個非結(jié)構(gòu)蛋白。E2在豬瘟病毒多聚蛋白上的位置始于氨基酸殘基690，終止于氨基端殘基1060，長約370個氨基酸。E2是CSFV主要的保護(hù)性抗原蛋白。CSFV依靠E2蛋白吸附和進(jìn)入敏感細(xì)胞，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，抵抗致死劑量的攻擊，而缺乏該蛋白的豬瘟病毒則不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。鑒于此，E2蛋白成為近年來血清學(xué)診斷抗原的主要對象[3]。

本研究對E2蛋白的主要抗原結(jié)構(gòu)域的特點進(jìn)行了分析，將優(yōu)化后的E2基因克隆至pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)并純化，Western blot分析重組蛋白的免疫原性，從而為建立一種快速、靈敏的以CSFV-E2為診斷抗原的檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物材料 大腸桿菌BL21（DE3)，質(zhì)粒pET-28a(+)由上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室保存。

1.2 主要試劑 BamH I、Hind III、10×QC·G·Buffer、TaKaRa BCA 蛋白檢測試劑盒購自TaKaRa生物技術(shù)公司；T7通用引物購自上海華津生物技術(shù)有限公司；Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自Whatman公司；羊抗豬IgG購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 重組豬瘟病毒E2主要抗原結(jié)構(gòu)域基因的構(gòu)建合成 根據(jù)GenBank中豬瘟病毒E2蛋白的基因序列，分析表達(dá)蛋白的主要B細(xì)胞抗原表位，找出主要抗原表位結(jié)構(gòu)域及對應(yīng)的基因序列，將多個抗原表位用不含支鏈的丙氨酸等串聯(lián)，在重構(gòu)的基因序列3'端加入TAA的終止序列，并分別在5'和3'端添加內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ位點?；蛐蛄蟹治雒艽a子偏向性并將稀有密碼子替換成大腸桿菌偏好密碼子，送至蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化 將目的基因連接到pET-28a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-E2，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單個菌落培養(yǎng)后進(jìn)行擴大培養(yǎng)，分別采用菌液PCR、抽取質(zhì)粒雙酶切和測序方法對重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性進(jìn)行鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒的表達(dá)及溶解性分析 將測序正確的含有重組質(zhì)粒pET-28a(+)-E2的宿主菌BL21(DE3)接種于含 Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中，250 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期（OD600約為0.6）。加入IPTG誘導(dǎo)，分別于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后1、2、3、4、6、8 h時，各取菌液1 mL，進(jìn)行SDSPAGE電泳鑒定，觀察最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間。

將誘導(dǎo)后的菌液8000×g離心15 min，收集菌體沉淀。用PBS重懸，反復(fù)凍融3次后，冰浴超聲破碎20 min。將超聲后的菌液4℃、8000×g離心15 min，收集上清與沉淀，沉淀溶于8 mol/L尿素，同樣條件離心收集上清。分別取超聲后上清和沉淀溶解上清，用SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)形式。

1.6 重組蛋白的純化 根據(jù)SDS-PAGE分析的重組蛋白表達(dá)形式，采用His·resin Bind樹脂柱層析的方法純化目的蛋白，收集各段時期的蛋白流出液，并進(jìn)行SDS-PAGE分析重組蛋白的純化效果；將純化后的重組蛋白用1×PBS透析，除去溶液中的咪唑。

1.7 Western blot檢測重組蛋白的免疫原性 將純化透析后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在冰浴條件下，將重組蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h后，PBST洗3次，每次10 min；然后1:100稀釋的豬瘟陽性血清作為一抗，37℃孵育2 h，同樣方法洗滌；以羊抗豬IgG（1:3000稀釋）為二抗，37℃孵育1 h，同樣方法洗滌后，HRP-DAB顯色試劑盒顯色，分析重組蛋白免疫原性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒菌液PCR、雙酶切及測序鑒定 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR、雙酶切及測序鑒定，結(jié)果顯示菌液PCR片段大小約750 bp（含部分載體序列），雙酶切后目的基因大小約500 bp，與構(gòu)建的目的基因大小相符，測序結(jié)果與目的基因序列一致。

圖1 重組質(zhì)粒PET28a(+)-E2的鑒定Fig.1 Identi fi ed the recombinant plasmid PET-28a(+)-E2

2.2 E2蛋白主要抗原結(jié)構(gòu)域基因序列 豬瘟病毒E2蛋

白全長約370個氨基酸，通過分析E2蛋白的B細(xì)胞抗原表位，將主要抗原表位進(jìn)行基因重構(gòu)后的序列長486 bp，預(yù)測表達(dá)一全長161氨基酸的蛋白。測序結(jié)果和預(yù)測相符，見圖2。

圖2 重構(gòu)的E2蛋白抗原表位基因序列（含兩個酶切位點序列）Fig.2 Reconstruction of antigen epitope gene sequence of E2 protein

2.3 重組蛋白的原核表達(dá)與可溶性分析 經(jīng)SDSPAGE分析顯示，pET-28a(+)-E2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)，在約23 kDa處有清晰的目的條帶，誘導(dǎo)1 h后表達(dá)量達(dá)到最高且趨于穩(wěn)定，重組蛋白rE2約占菌體總蛋白的10%（圖3）。對蛋白溶解性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該重組蛋白rE2為可溶性蛋白（圖4）。

圖3 pET-28a(+)-E2表達(dá)時相Fig.3 Phase expression of PET-28a(+)-E2

圖4 重組蛋白rE2溶解性分析Fig.4 Solubility analysis of rE2 protein

2.4 重組蛋白rE2的純化 取表達(dá)1 h的菌液裂解物上清，經(jīng)Ni-NTA His Bind Resin 樹脂純化，獲得了較純的重組蛋白（圖5），目的蛋白條帶約23 kDa。

2.5 Western blot檢測重組蛋白的免疫原性 用人工感染豬瘟的豬血清進(jìn)行Western blot，在約23 kDa處出現(xiàn)印跡條帶，證實重組蛋白具有免疫原性（圖6）。

圖5 重組蛋白純化結(jié)果Fig. 5 Puri fi cation result of rE2 protein

圖6 重組蛋白的免疫原性分析Fig.6 Analysis of pET-28a(+)-E2 immunogenicity by Western blot

3 討論

豬瘟是豬的一種急性接觸性傳染病，又稱豬霍亂，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。它不僅是臨床上最常見的豬病，而且經(jīng)過多年的防治仍會發(fā)生，很難根除。治療豬瘟最有效的方法需要及時準(zhǔn)確的診斷，目前可通過免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗法、血清中和試驗、瓊脂糖凝膠沉淀試驗等進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)的豬瘟病毒檢測均以豬瘟病毒野毒株或弱化毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物等作為診斷抗原，而這些完整的全毒株的純化過程價格昂貴，操作繁雜、成本較高，為豬瘟病毒的臨床檢測帶來阻礙。

E2是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白，在體外E2蛋白可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生病毒中和抗體，體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CSFV攻擊的抗體。E2蛋白由多聚蛋白的Arg690至Leu1060之間的370個氨基酸殘基組成，位于病毒囊膜表面，參與病毒的感染過程。Wensvoort等[4]研究表明E2蛋白表面單抗決定簇可以分為4個抗原結(jié)構(gòu)域，命名為A、 B、C、D。4個抗原結(jié)構(gòu)域都位于E2蛋白N端690～866位氨基酸之間，而866位氨基酸以后的結(jié)構(gòu)不參與抗原結(jié)構(gòu)域的形成，所以690～866位氨基酸是E2蛋白最具有抗原性的部分[5]（圖7）。A1、A2、A3三個亞結(jié)構(gòu)抗原結(jié)構(gòu)域組成了A抗原結(jié)構(gòu)域。A1、A2區(qū)域比較保守，其他區(qū)域不保守。A抗原區(qū)位于766位氨基酸與866位氨基酸之間，保守的A1與A2亞區(qū)位于795位氨基酸與851位氨基酸之間，B抗原結(jié)構(gòu)區(qū)位于690位氨基酸與733位氨基酸之間，C抗原結(jié)構(gòu)區(qū)位于690位氨基酸與800位氨基酸之間，D抗原結(jié)構(gòu)域位于766位氨基酸與800位氨基酸之間[6]。Zhou等[7]通過研究E2蛋白的這些區(qū)域的B細(xì)胞抗原表位，證明其具有良好免疫保護(hù)力。

圖7 E2蛋白基因結(jié)構(gòu)圖Fig.7 The structure diagram of E2 protein

鑒于E2蛋白的特性，E2蛋白常作為臨床上的診斷抗原。E2蛋白分子量較大，含有一些非抗原表位的結(jié)構(gòu)域，可能增加診斷的非特異性，而且研究表明E2糖蛋白的C端有一段含有約30個氨基酸殘基組成的跨膜區(qū)（transmembrane region，TMR)，很難在大腸桿菌中得到可溶性表達(dá)。近年來，張永國等[8]學(xué)者利用豬瘟病毒E2蛋白的抗原結(jié)構(gòu)表位域表達(dá)純化作為診斷抗原，但結(jié)果多為包涵體表達(dá)，在復(fù)性過程中加入的變性劑和去垢劑等易引起蛋白的不可逆修飾及性質(zhì)的改變，甚至有些純度較低。本研究從GenBank中搜索E2蛋白的相關(guān)基因序列，分析表達(dá)蛋白包含的B細(xì)胞抗原表位，將11個較為集中的抗原表位分別用兩個丙氨酸連接，重構(gòu)了表達(dá)E2蛋白抗原表位的基因序列。

影響外源基因表達(dá)水平的因素很多，密碼子的選擇可能是影響表達(dá)的參數(shù)之一。盡管大多數(shù)氨基酸的遺傳密碼子是簡并的, 但在原核和真核基因上簡并密碼子的使用并不是隨機的, 基因表達(dá)水平與嗜好密碼子的使用程度之間存在強的相關(guān)性。為了在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)E2蛋白抗原表位的基因，本課題嘗試優(yōu)化密碼子序列以提高表達(dá)水平。

通過密碼子優(yōu)化的表達(dá)E2蛋白抗原表位的基因序列，成功的構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒并在宿主菌獲得了可溶性表達(dá)。表達(dá)目的蛋白占全菌蛋白的10%。由于目的蛋白存在于細(xì)菌裂解物的上請中，方便采用親和層析進(jìn)行蛋白純化。但在親和層析時，部分目的蛋白被緩沖液洗脫，在洗脫液中依然保持大量的目的蛋白。

重組多表位抗原的原核表達(dá)不僅實現(xiàn)了蛋白的簡單純化，而且表達(dá)量穩(wěn)定，降低了重組抗原的生產(chǎn)成本，同時改變了以CSFV野毒株或弱化毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物等作為診斷抗原的危險性。對表達(dá)產(chǎn)物的抗原性分析表明，重組蛋白E2能與CFSV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，保留了E2蛋白良好的免疫原性，為后續(xù)建立與完善豬瘟抗體檢測奠定了堅實的基礎(chǔ)。

[1] Fauquet C M, Mayo M A, Maniloff J, et al .VirusTaxonomy: The Eighth Report of the International Commit tee on Taxonomy of Viruses [M]. San Diego,Calif: Elsevier Academic Press, 2005.

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CLONING AND EXPRESSION OF SURFACE ANTIGEN E2 OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

WU Si-min1,2, WANG Zhao-zhe1, XU Rui1, LIN Jiao-jiao1, HONG Yang1, CHEN Zhao-guo1, LU Ke1,LI Hao1, SHI Yao-jun1, JIANG Jia-xin1,2, LI Jia-jing1,2, ZHU Chuan-gang1, TANG Ya-lan1

(1.Natural Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Key Laboratory for Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. YingDong College of Life Science, Shaoguan University, Guangdong,Shaoguan 512000, China)

In order to obtain recombinant E2 protein of Classical swine fever virus (CSFV), B cell antigen epitope was re-constructed and expressed in E. coli. The recombinant gene sequence was cloned into pET-28a(+) and inserted into BL21(DE3), The recombinant fusion protein was expressed with induction of IPTG and puri fi ed using Ni-NAT His·Bind Resin. Results showed that the reconstructed gene for multiple antigen epitope were about 500 bp, which was consistent with the results of PCR and double restriction digestion. Recombinant protein was soluble and molecular weight was about 23 kDa. Western blot showed that the recombinant protein reacted with positive swine fever antiserum. The recombinant protein may be used to develop diagnostic assays for swine fever.

Classical swine fever virus; E2 gene; prokaryotic expression; protein puri fi cation

S852.651

A

1674-6422（2017）05-0032-05

2017-01-19

國家重點研發(fā)計劃（2017XFD0501306）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費（2017JB20）

吳思敏，女，生命科學(xué)專業(yè)

朱傳剛，E-mail: zcg@shvri.ac.cn