周 鵬，歐陽金旭，江 濤，龍 萍，程太平，汪招雄

（1.長江大學動物科學學院，荊州 434025；2.湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州 434020）

2013～2015年湖北省規(guī)?；半u場H9N2亞型禽流感疫苗免疫效果調(diào)查

周 鵬1，歐陽金旭2，江 濤1，龍 萍1，程太平1，汪招雄1

（1.長江大學動物科學學院，荊州 434025；2.湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州 434020）

禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒（Influenza A Virus，IAV）感染禽類引起的一種高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)為從呼吸系統(tǒng)到全身嚴重敗血癥等多種癥狀。為了解近年來湖北省H9N2亞型禽流感疫苗的免疫效果，2013年6月到2015年12月從湖北省規(guī)?；半u場隨機采取樣本共6648份，用血凝抑制實驗（hemagglutination inhibition，HI）測定了H9N2亞型禽流感抗體滴度。對不同月份樣本進行分析顯示，2013年8月平均抗體滴度最低為8.7 log2，10月的平均抗體滴度最高為9.44 log2，但依然小于2014和2015年的最小平均抗體滴度。2014年1月的平均抗體滴度最低（9.62 log2），5月的平均抗體滴度最高（12.34 log2），2015年的6月平均抗體滴度最低（10.24 log2），11月平均抗體滴度最高（13.03 log2）；對不同日齡樣本進行分析顯示，蛋雞的平均抗體滴度隨著日齡的增加而增加，不同階段的蛋雞的抗體滴度平均值呈現(xiàn)遞增現(xiàn)象，且都大于9 log2，但是在120＜日齡≤200的蛋雞中抗體滴度部分值小于4 log2，存在著離散度大，極差大的特點；3年的平均抗體滴度對比顯示，2013～2015年平均抗體滴度呈現(xiàn)遞增現(xiàn)象，且都大于9 log2。檢測結(jié)果顯示，H9N2亞型禽流感疫苗的總體免疫效果良好，能達到保護雞群受同種毒株感染的目的，但是不同月份、不同日齡的平均抗體滴度存在差異。

禽流感病毒；H9N2亞型；抗體滴度；檢測

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于RNA病毒的正黏病毒科，分為甲、乙、丙3個型。其中甲型禽流感病毒主要感染禽類，一些亞型也可感染各種哺乳動物以及人類。甲型禽流感外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）抗原容易變異，根據(jù)其蛋白質(zhì)的抗原性不同，可將其分為不同的亞型，目前為止，已知HA有18個亞型（H1～H18系列），NA有11個亞型（N1～N11系列）[1,2]。根據(jù)致病力大小可將禽流感病毒分為高致病性和低致病性，其中高致病性禽流感病毒以H5N1型AIV為代表，能夠引起疫情暴發(fā)，導致大量雞的死亡，因而受到了人們的重視。低致病性禽流感病毒以H9N2型AIV為代表，該病毒沒有特殊的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，對外界環(huán)境的抵抗力較弱，但是可以伴隨著分泌物和糞便排出，受到有機物的保護而極大地增強了其抗滅活的能力，病毒能存活較長時間，在外界因素的影響下發(fā)生移動，擴大了其傳染范圍，并且容易變異為高致病性毒株，可感染人類[3-5]。可見低致病性AIV也關(guān)系到人類的健康和養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，應該引起人們足夠的重視[6]。

H9N2亞型禽流感的防疫在國內(nèi)主要采用滅活疫苗免疫的方式，幾乎所有規(guī)?；半u場都進行了該疫苗的預防接種。目前我國使用的疫苗毒株有HP株、WD株、SS/94株、HL株、SD696株、Sy株、LG1株、L株、YBF003株、F株、S2株和NJ02株等毒株。由于氣候、管理、免疫程序、雞群的品種、接種劑量及疫苗質(zhì)量差異等原因，導致各雞群禽流感抗體水平參差不齊[7,8]。本實驗室2013～2015連續(xù)3年對湖北省規(guī)模化蛋雞場H9N2亞型禽流感免疫效果進行了檢測，了解了疫苗免疫效果的差異，分析差異可能存在的原因，為H9N2亞型禽流感的疫苗使用方法和免疫程序的制定提供科學的依據(jù)，對防控H9N2禽流感的發(fā)生和流行具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 H9N2亞型禽流感血凝抑制試驗標準抗原、陽性血清購自中國哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；0.85%生理鹽水、3.8%檸檬酸鈉抗凝劑。

1.2 方法

1.2.1 血液采集及血清制備 對湖北省規(guī)?；半u場的雞隨機采血，每只翅下靜脈采血2 mL。2013年6月～2015年12月檢測樣本6648份，其中2013年檢測樣本1621份數(shù)據(jù)，2014年檢測樣本2190份，2015年檢測樣本2837份。采集血樣靜置1 h，待血清析出后，1000×g離心5 min，取上層血清待檢。

1.2.2 1%紅細胞懸液制備 用一次性注射器采取健康非免疫公雞血液，加入抗凝劑混勻；然后1000×g離心5 min，吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，再次在離心管中加生理鹽水，慢慢混合均勻，1000×g離心5 min，棄去上清液，按照上述方法反復操作4～5次，直到上清液透明，最后1次離心后的紅細胞，棄去上清液，用紅細胞泥配制1% 紅細胞懸液。

1.2.3 4單位抗原配制 取出凍干的濃縮抗原，加入2～3 mL生理鹽水稀釋融化后，測其抗原效價，能夠完全引起血凝的病毒最高稀釋度視作抗原的效價，配制4個 HA 單位抗原。

1.2.4 待檢樣品測定 根據(jù)HA操作規(guī)范對血清樣品進行檢測，設置陰性和陽性對照。

1.2.5 結(jié)果判定 在紅細胞對照出現(xiàn)完全沉淀，病毒對照出現(xiàn)完全凝集的情況下，將反應板作45度傾斜，從反應板背側(cè)進行讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 2013～2015年規(guī)?；半u場H9N2亞型禽流感抗體滴度 2013年到2015年H9N2亞型禽流感平均抗體滴度有增高的趨勢，2013年的平均數(shù)據(jù)為9.22 log2，2014年的平均數(shù)據(jù)為10.9 log2，2015年最高，為11.32 log2。3年的平均數(shù)據(jù)均大于9 log2，表明H9N2亞型禽流感疫苗的免疫效果良好，能達到保護雞群免受同型病毒的感染（圖1）。

圖1 2013～2015年規(guī)模化蛋雞場H9N2亞型禽流感平均抗體滴度Fig.1 The average antibody titer of H9N2 subtype AIV in layer farm from 2013 to 2015

2.2 2013～2015年不同月規(guī)?；半u場H9N2亞型禽流感抗體滴度 對2013年6～12月共1621份數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，8月H9N2型AIV的平均抗體滴度較低，為8.71 log2，10月的平均抗體滴度值最高，為9.55 log2。8、9月平均值低于7個月的平均值9.23 log2，并且有少數(shù)樣本抗體滴度小于6 log2，集中于8、9、10月份（表1）。

表1 2013年不同月份蛋雞H9N2亞型禽流感抗體滴度Table 1 The antibody titer of H9N2 subtype AIV in different month in 2013

對2014年1～12月共2190份數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，1月H9N2型AIV的抗體滴度平均值最低（9.62 log2），5月最高（12.3 log2），1～5月的平均值呈現(xiàn)遞增現(xiàn)象。1、2、3、6、7、8、9、10月低于12月的平均值10.90 log2。6月部分樣本抗體滴度值小于4 log2，存在著極差大，離散度大的特點（表2）。

表2 2014年不同月份蛋雞H9N2亞型禽流感抗體滴度Table2 The antibody titer of H9N2 subtype AIV in different month in 2014

對2015年12個月共2837份數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計顯示，6月抗體滴度平均值最低（10.24 log2），11月抗體滴度平均值最高（13.03 log2），1、2、6、8、10月的平均值低于12月的抗體滴度平均值11.32 log2。少部分樣本值低于6 log2，其中以4、6、10、12月偏多（表3）。

表3 2015年不同月份蛋雞H9N2亞型禽流感抗體滴度Table 3 The antibody titer of H9N2 subtype AIV in different month in 2015

對2013～2015年3年間共6648份數(shù)據(jù)每個月的抗體滴度平均值進行分析顯示，2013年7個月的數(shù)據(jù)平均值整體低于2014年和2015年，2014年和2015年1、2、6、7月的數(shù)據(jù)和10月的數(shù)據(jù)就全年相比之下偏低。2013年在8月和9月的數(shù)據(jù)偏低。2014和2015年在5、11和12月數(shù)據(jù)在全年都偏高，2013年的數(shù)據(jù)在7、10和12這3個月的數(shù)據(jù)在全年來看略高但都小于2014年和2015年的數(shù)據(jù)（圖2）。

圖2 2013～2015年規(guī)?；半u場不同月份H9N2亞型禽流感平均抗體滴度分布圖Fig.2 The average antibody titer of H9N2 subtype in different month from 2013 to 2015

2.3 2013～2015年湖北省規(guī)模化蛋雞場不同階段蛋雞H9N2亞型禽流感抗體滴度分析 對2013～2015年的不同階段的蛋雞的抗體分布進行了統(tǒng)計，2013～2015年期間，在120～200日齡的蛋雞的抗體滴度小于6 log2的較多，且抗體的離散度較大，2014年在120日齡以下的蛋雞中抗體滴度小于6 log2的偏多，離散度較大，2015年小于120日齡的以及日齡在200～300 d之間的蛋雞中H9N2 AIV抗體滴度小于6 log2的偏多，離散度也較大（見表4）。

表4 2013～2015年規(guī)模化蛋雞場不同日齡蛋雞中H9N2亞型禽流感抗體滴度Table 4 The antibody titer of H9N2 subtype AIV in chicken of different day-old from 2013 to 2015

對2013～2015年不同日齡蛋雞的H9N2亞型禽流感抗體滴度平均值進行分析，不同日齡階段的蛋雞的抗體滴度平均值都呈現(xiàn)遞增現(xiàn)象，并且，1年之中隨著日齡的增長，抗體滴度平均值也呈現(xiàn)遞增。3年來不同階段的抗體滴度平均值都在9 log2之上，能達到保護不同日齡的雞群免受同種毒株的感染（圖3）。

圖3 2013～2015年規(guī)?；半u場不同日齡蛋雞中H9N2亞型禽流感平均抗體滴度分布圖Fig.3 The average antibody titer of H9N2 subtype AIV in different day-old chicken of from 2013 to 2015

3 討論

本實驗收集了2013～2015年3年期間來自湖北省多個規(guī)?；半u場共6648個樣本，分別從不同日齡、不同月份以及不同年份的3個方面對H9N2亞型禽流感抗體進行了統(tǒng)計分析和總結(jié)。

根據(jù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析可以得知，湖北省近3年來平均抗體滴度在9 log2以上，整體上效果較好，能達到保護雞群免受同種毒株的感染。H9N2亞型禽流感平均抗體滴度一年比一年高，2015年的平均抗體滴度達到11.32 log2，這表明H9N2亞型禽流感的免疫獲得了良好的效果，能夠達到保護雞群受到同種毒株的感染。免疫效果的提升，直接表明了養(yǎng)殖企業(yè)加強了相關(guān)的防疫意識。

2014、2015年1～2月H9N2亞型禽流感抗體滴度平均值相較于其他幾個月檢測的樣本略偏低，原因可能與氣候突變，溫度降低，雞舍通風不暢有關(guān)。一方面氣候的突變能引起雞群的產(chǎn)生強烈的的應激反應，另一方面，該病毒在低溫環(huán)境下容易生存，使得病毒的傳播更加容易。冬季溫度低，雞群感染病毒的幾率較秋夏季高，因此養(yǎng)殖人員和企業(yè)一方面要做好保溫措施，降低雞體的免疫應激反應，另一方面，要嚴格的執(zhí)行科學的免疫程序，保證對雞群H9N2亞型禽流感疫苗合理的免疫密度。相較于其他幾個月檢測樣本，2013年8、9月，2014年6、7月，2015年年6月樣本抗體效價均值較低，養(yǎng)殖人員和企業(yè)要在夏季做好降溫措施，盡量降低雞群機體的免疫應激反應，提高免疫效果，制定科學的免疫程序，保證雞群對H9N2亞型禽流感合理的免疫密度[9]。

為了方便調(diào)查研究，把2013年到2015年這3年的蛋雞進行了4個年齡階段的劃分，分別是青年雞（日齡≤120 d）、初步進入產(chǎn)蛋高峰期（120 d＜日齡≤200 d）、產(chǎn)蛋高峰期（200 d＜日齡≤300 d）和產(chǎn)蛋下降期（日齡＞300 d）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，3年來不同階段的H9N2亞型禽流感抗體滴度的平均值都較高，都高于9 log2 ，2014年和2015年的均值超過了10 log2，這表明了不同階段的雞群都能得到保護，H9滅活疫苗取得了良好的免疫效果。隨著日齡的增加，雞群H9N2亞型禽流感抗體滴度的平均值不斷上升。但是3年來日齡在120～200 d天這個階段的抗體滴度小于6 log2數(shù)據(jù)較多，存在離散度大、極差大、整齊度不好的特點，這表示部分雞群產(chǎn)生抗體的能力存在著差異。可能是因為雞群在進入產(chǎn)蛋期后，免疫不均、免疫程序不合理，也可能是因為雞只免疫抑制的原因或者其他原因，值得進一步進行跟蹤調(diào)查[10]。

統(tǒng)計結(jié)果顯示，近3年來，H9滅活疫苗在各個雞場都取得了良好的免疫效果，養(yǎng)殖企業(yè)也加強了對雞群的管理。但是，某些雞群H9N2亞型禽流感抗體滴度仍然存在著離散度大、極差大、整齊度不好等特點。免疫接種是預防H9N2亞型禽流感最有效的方法之一，國內(nèi)目前使用的H9N2毒株有HP株、WD株、SS/94株、HL株、SD696株等十幾個毒株，疫苗的種類有有單價滅活疫苗、二聯(lián)滅活疫苗和三聯(lián)滅活疫苗[11]，各種各樣的疫苗增加了養(yǎng)殖人員和相關(guān)企業(yè)的選擇疑惑和難度；除了疫苗自身的質(zhì)量原因之外，科學的制定和嚴格的執(zhí)行免疫程序的接種方式、時間、次數(shù)、接種量、操作方式、藥物影響和盲目聯(lián)合使用應用疫苗等，以及疫苗的保管存放，也是免疫成敗的關(guān)鍵?，F(xiàn)在雞群的養(yǎng)殖密度高，給雞群的管理和養(yǎng)殖環(huán)境的治理增加了一定的難度。同時，雞群本身抗體存在著差異等原因，導致臨床上經(jīng)常出現(xiàn)H9感染雞群的案例[12]，因此開展H9禽流感分子流行病學調(diào)查，調(diào)整疫苗毒株，幫助養(yǎng)殖人員和相關(guān)企業(yè)制定科學合理的免疫程序顯得尤為重要。

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EFFICACY OF H9N2 AVIAN INFLUENZA VIRUS VACCINE IN LARGE SCALE LAYER FARMS IN HUBEI PROVINCE FROM 2013 TO 2015

ZHOU Peng1, OUYANG Jin-xu2, JIANG Tao1, LONG Ping1, CHENG Tai-ping1, WANG Zhao-xiong1

(1.College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. Animal Husbandry Bureau of Jingzhou City, Hubei Province,Jingzhou 434020, China)

Avian in fl uenza is a highly contagious disease caused by in fl uenza A virus and affects from the respiratory system to seriously systemic sepsis and other symptoms. In order to investigate efficacy of H9N2 subtype avian influenza vaccine on larger-scale layer farms in Hubei province, 6648 blood samples were randomly collected from June 2013 to December 2015. The antibody levels of H9N2 subtype avian in fl uenza virus were determined by hemagglutination inhibition (HI). The results showed that the lowest antibody titers were 8.7 log2 in August and the highest titers 9.44 log2 in October of 2013, the lowest titers were 9.62 log2 in January and the highest tiers 12.34 log2 in May of 2014, and the lowest titers were 10.24 log2 in June and the highest tiers 13.03 log2 in November of 2015. Theaverage antibody titers of the chickens at different ages showed an increasing phenomenon, reaching to more than 9 log2. However, some of the antibody titers were less than 4 log2 when chickens were between 120 - 200 days old. The investigation concluded that the antibody level of H9N2 subtype avian in fl uenza vaccine was good in general on layer farms in Hubei province. However, some differences in the antibody titers of H9N2 subtype avian in fl uenza vaccine were observed in different ages and months of the years.

Avian in fl uenza; H9N2 subtype; antibody titer; detection

S85.659.5

A

1674-6422（2017）05-0026-06

2016-10-02

長江大學?；稹㈤L江大學青年基金

周鵬，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

汪招雄，E-mail：luke751751@163.com