蔡驍垚，孫竹筠，熊 煒，陳懿斐，林穎崢，張 泉，李澤君，魏曉鋒，陳鴻軍

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009；3.上海實驗動物研究中心，上海201203；4.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135）

鼠輪狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

蔡驍垚1,2，孫竹筠1，熊 煒3，陳懿斐4，林穎崢3，張 泉2，李澤君1，魏曉鋒4，陳鴻軍1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009；3.上海實驗動物研究中心，上海201203；4.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135）

根據(jù)鼠輪狀病毒（Murine rotavirus, MRV）EB-C8/G16P毒株VP1基因（GenBank登錄號：KJ477127.1），設計引物和TaqMan探針，確定標準曲線，建立MRV熒光定量PCR方法，檢測其特異性、敏感性和穩(wěn)定性。結果顯示，建立的MRV熒光定量PCR方法標準曲線的線性關系良好，R2值可達0.99；最低可檢測到10 copies/μL，是常規(guī)PCR的100倍；與常見的小鼠病毒株均無特異性擴增；批內和批間變異系數(shù)均小于2%，表明該方法重復性好。將建立的熒光定量PCR初步對246份小鼠腸道樣品病料進行檢測，結果均為陰性。本研究建立的MRV熒光定量PCR方法特異性、靈敏性良好，可為鼠輪狀病毒的流行病學調查、檢測以及制定國家標準和地方標準提供可靠的數(shù)據(jù)和適用的監(jiān)測方法。

鼠輪狀病毒；TaqMan；熒光定量PCR

鼠輪狀病毒（Murine rotavirus，MRV）為雙股RNA病毒，在小鼠中普遍存在，可造成乳鼠流行性腹瀉（epidemic diarrhea of mice，EDIM）。我國開放飼養(yǎng)的小鼠中EDIM發(fā)生率很高[1]。MRV屬呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，外殼具有區(qū)別于其他輪狀病毒的特異性抗原。MRV屬于A組輪狀病毒，與嬰幼兒的輪狀病毒有交叉反應，而與乳大鼠的B組輪狀病毒沒有交叉反應，所以MRV只引起乳小鼠的發(fā)病。小鼠是EDIM病毒的唯一自然宿主。EDIM主要高發(fā)于第一胎15日齡以內的乳鼠，可通過消化道和呼吸道傳播，是一種高度接觸性傳染病。乳鼠可表現(xiàn)腹瀉、發(fā)育遲緩、脫水等癥狀，偶爾死亡。成年小鼠呈隱性感染并不斷向外排毒。

由于MRV感染在臨床上易與由其他因素引起的腹瀉相混淆，給診斷帶來一定的難度。目前，人們還未對這一病毒感染給予足夠的重視。小鼠發(fā)生腹瀉后往往是從細菌感染、飼料、氣候等方面來考慮[2]，很容易忽略MRV隱性感染這一因素，從而給生產群以及種群帶來了潛在的危害。本研究擬建立一種快速、簡便、敏感、特異的MRV熒光定量PCR檢測方法，為監(jiān)測MRV提供方法支持，從而可及時監(jiān)測實驗鼠的健康狀況，降低因實驗鼠感染造成嚴重的經濟損失[3-5]。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株 小鼠微小病毒、小鼠細小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒A59株、仙臺病毒均由上海實驗動物研究中心提供。

1.2 標準品質粒構建與引物設計 以鼠輪狀病毒EB-C8/G16P[6]毒株VP1基因（GenBank登錄號：KJ477127.1）為參考，選取2421～2528 nt這一段特異區(qū)域序列，送GENEWIZ公司合成，與pUC57載體連接，構建pUC-MRV的質粒標準品。通過BLAST比對分析設計引物和探針，其序列如下：qMRV-F（上游引物）：5'-AATTGCTTCTTCAGCCACATT C-3'；qMRV-R（下游引物）：5'-CCTTCTCGGT CTGTGCTATTC-3'；FAM-MRV（探針）：5'-FAM-ACGTTAACCTGCTATCAGAGCAGCTG-3'-BHQ1。

1.3 熒光定量PCR方法反應體系及反應條件 采用矩陣法優(yōu)選定量引物和探針的最佳濃度，在Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀上進行，使用TaKaRa ExTaq HS kit，擴增反應總體系為20 μL，其中Premix ExTaq （Probe qPCR）（2×）使用量為10μL，ROX Reference Dye II（50×）使用量為0.2 μL，DNA模板使用量2 μL，經優(yōu)化后的上、下游定量引物（10 μmol/mL）各0.4 μL，探針（10 μmol/mL）0.8 μL，用滅菌蒸餾水補足20 μL。采用優(yōu)化后的反應程序進行反應，反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，并采集熒光40個循環(huán)。

1.4 敏感性、特異性和重復性 將3×108copies/μL MRV的質粒標準品進行10倍梯度稀釋，用于敏感性測試；用小鼠中常見的小鼠微小病毒、小鼠細小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒A59株、仙臺病毒進行方法的特異性測試；以1×106copies/μL和1×104copies/μL稀釋度的MRV質粒標準品作為模板，進行重復性測試。

1.5 臨床樣品檢測 上海實驗動物研究中心采集小鼠小腸樣品246份，按上述方法提取基因組DNA，稀釋到100 ng/μL作為模板，使用建立的MRV熒光定量PCR方法檢測。

2 結果

2.1 pUC-MRV質粒合成及普通PCR結果 選取鼠輪狀病毒EB-C8/G16P[6]毒株VP1基因2421～2528 nt作為合成對象，與pUC57載體連接，構建pUCMRV的質粒標準品，并以10倍梯度稀釋，選取濃度1×106～1×100copies/μL，利用上下游引物PCR擴增，結果顯示，普通PCR最低可以檢測到1×103copies/μL。

2.2 熒光定量PCR的標準曲線 將pUC-MRV的質粒標準品以10倍梯度稀釋為1×107～1×100copies/μL。按pUC-EMV質粒標準品1×108copies/μL為起始模板濃度，以稀釋次數(shù)和相應的Ct值繪制出標準曲線，見圖2?？山Y果顯示其相關系數(shù)R2均大于0.99，標準曲線都具有良好的線關系，各個稀釋度相關性好，誤差較小。

圖1 常規(guī)PCR檢測結果Fig.1 Sensitive of the conventional PCR for detecting MRV

圖2 TaqMan熒光定量PCR檢測標準曲線Fig. 2 Standard curve of TaqMan real-time fl uorescent quantitative PCR

2.3 敏感性試驗 以pUC-MRV質粒標準品為模板，進行10倍梯度稀釋為1×107～1×100copies/μL，采用熒光定量PCR擴增，Ct值大于35，視為陰性。結果見圖3，TaqMan方法檢測靈敏度較高，可達10 copies/μL，而常規(guī)PCR方法，只能檢測到1×103copies/μL（圖1）。

2.4 特異性試驗 通過建立的MRV TaqMan熒光定量PCR檢測方法，分別對小鼠微小病毒、小鼠細小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒A59株、仙臺病毒進行檢測，除輪狀病毒有特征性擴增曲線外，其他病毒均沒有特征性的擴增曲線，證明建立的MRV TaqMan熒光定量PCR檢測方法特異性強，與其他小鼠病毒均無交叉反應（圖4）。

2.5 重復性試驗 以pUC-MRV質粒標準品中的1×106和1×104copies/μL兩個稀釋度作為模板，對這兩個稀釋度在不同時間段進行2次重復測定，每次對同一模板同時進行3次重復測定即設置3個重復孔，按照優(yōu)化的擴增體系和條件進行實時熒光定量PCR。結果表明，批內和批間變異系數(shù)均小于2%，說明建立的MRV熒光定量PCR方法具有較好的重復性，結果穩(wěn)定可靠（表1）。

圖3 TaqMan熒光定量PCR檢測動力學曲線Fig.3 Dynamic curve of TaqMan real-time fl uorescent quantitative PCR

圖4 TaqMan熒光定量PCR檢測方法的特異性Fig.4 Speci fi city of TaqMan fl uorescent quantitative PCR

2.6 臨床樣品檢測 使用建立的MRV TaqMan熒光定量PCR方法對246份來自上海實驗動物研究中心的小鼠腸道樣品進行檢測。以MRV質粒標準品為陽性對照，無RNA酶水為陰性對照。檢測結果顯示，在收集的樣品中，并未檢測到MRV感染。

3 討論

MRV對乳鼠的感染性很強，一旦小鼠中出現(xiàn)腹瀉癥狀，則群體中全部乳鼠遲早都會被感染，即便小鼠被治愈，但也生長緩慢，對于生產和動物實驗都是沒有意義的。同時這些病愈的小鼠以及親代母鼠都可能帶毒，因此必須要盡早檢測出發(fā)病小鼠，立即淘汰發(fā)病小鼠及親代母鼠，從而逐步消除MRV感染[7]，所以MRV感染應該引起高度注意的，而建立一種特異性強、靈敏度高的檢測方法，對MRV進行實時監(jiān)控是有必要的。

小腸是輪狀病毒感染小鼠之后出現(xiàn)病變的主要部位，同時也是病毒增殖的最主要部位，所以一般采集動物的腸道組織進行分析檢測。由于MRV不能在細胞培養(yǎng)中生長，只能以牛和猴的輪狀病毒做抗原檢測抗體[3-6]，檢測極為不便。目前常規(guī)的MRV檢測方法是根據(jù)流行病學、臨床癥狀和病理解剖特點作出初步診斷，然后取病料如小鼠小腸內容物進行病毒分離，再接種4～14日齡無菌小鼠，4 d后取小腸研磨提純，電鏡下可見典型病毒離子。同時，還可用血清學方法如免疫熒光試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測病毒抗體。

實時熒光定量PCR是鼠病毒的主要檢測手段之一[8,9]，具有操作簡便、靈敏度高、特異性好等特點。TaqMan熒光定量PCR利用上、下游引物及探針使反應的特異性，具有雙重保證，從而確保檢測結果的可靠性，同時也能達到檢測的一個高靈敏度。本研究利用TaqMan探針法的優(yōu)勢，建立了MRV TaqMan熒光定量PCR的檢測方法，特異性地針對病毒核酸進行檢測，不僅可以實現(xiàn)對實驗小鼠的大樣本篩查，也可以對細胞系和生物原材料進行外源因子檢測。運用建立的檢測方法對采集的小鼠腸道樣品進行MRV的感染情況檢測，結果提示，采集的樣品中并無MRV感染。本研究建立的檢測方法可為國家標準和地方標準制定提供可靠的數(shù)據(jù)和適用的監(jiān)測方法。

表1 熒光定量PCR檢測方法的重復性Table 1 Repeatability of TaqMan real-time fl uorescent quantitative PCR

[1] 魏強, 陳中, 蘇樹蕓, 等. 小鼠輪狀病毒的形態(tài)發(fā)生及感染MRV乳鼠小腸上皮細胞超微病變的觀察[J]. 中國實驗動物學雜志, 1991, 1(3): 174-178.

[2] 賀爭鳴. 小鼠輪狀病毒感染[J]. 北京實驗動物科學,1989, 6(3): 7-10.

[3] 王吉, 衛(wèi)禮, 鞏薇, 等. 2003-2007年我國實驗小鼠病毒抗體檢測結果與分析[J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2008,28(6): 394-396.

[4] 魏巍, 劉霄磊, 劉家森, 等. 大小鼠主要病毒血清抗體檢測結果與分析[J]. 實驗動物科學, 2011, 28(6): 23-25.

[5] Clifford C B. Routine health monitoring of Charles River rodent barrier production colonies in Europe and North America[EB/OL]. www.criver.com/files/pdfs/pdfs/rms/rabbit_hmsummary.aspx.

[6] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB14922.2-2011實驗動物微生物等級及監(jiān)測[S]. 北京: 中國標準出版社, 2011.

[7] 魏強, 叢喆, 吳小閑. 小鼠輪狀病毒快速診斷方法的建[J]. 中國實驗動物學雜志, 1995, 5(4): 235-236.

[8] Besselsen D G, Romero M J, Wagner A M, et al.Identification of novel murine parvovirus strains by epidemiological analysis of naturally infected mice [J]. J Gen Virol, 2006, 87(Pt6), 1543-1556.

[9] Zhan D, Roy M R, Valera C, et al. Detection of minute virus of mice using real time quantitative PCR in assessment of virus clearance during the purification of mammalian cell substrate derived biotherapeutics[J].Biologicals, 2002, 30(4): 259-270.

DEVELOPMENT OF REAL-TIME RT-PCR FOR DETECTION OF MURINE ROTAVIRUS

CAI XIAO-yao1,2, SUN Zhu-yun1, XIONG Wei3, CHEN YI-fei4, LIN Ying-zheng3, ZHANG Quan2,LI Ze-jun1, WEI Xiao-feng4, CHEN Hong-jun1

(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University,Yangzhou 225009, China;3.Shanghai Lab. Animal Research Center, Shanghai 201203, China; 4. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

To develop real-time PCR for detection of Murine rotavirus (MRV), one pair of primers and TaqMan probe were designed according to the genomic sequence of VP1 gene of EB-C8/G16P strain (GenBank access No. KJ477127.1). The linearity, speci fi city and sensitivity of the method were optimized. The results showed an excellent linear relationship of standard curve, in which R2value reached up to 0. 99. Variation coef fi cient between batches was less than 2%. The sensitivity of the TaqMan-probe real-time PCR was 10 copies/μL,i.e. 100 times higher than that of ordinary PCR method. The PCR method did not react with other mouse strains tested, indicating good speci fi city. Total 246 mouse samples were tested and all were negative.

Murine rotavirus; TaqMan; real-time PCR

S852.659.4

A

1674-6422（2017）05-0017-04

2016-11-22

上海市科委實驗動物專項資金資助（15140900600）

蔡驍垚，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)；孫竹筠，女，碩士，主要從事動物生態(tài)毒理研究

陳鴻軍，E-mail：vetchj@shvri.ac.cn；魏曉鋒，E-mail：wei.xf@outlook.com