宮 婷，扈榮良

（1.遼寧省本溪市桓仁滿族自治縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，桓仁滿族自治區(qū) 117200；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130122）

豬圓環(huán)病毒2型一步間接免疫熒光試驗(yàn)的建立及初步應(yīng)用

宮 婷1，扈榮良2

（1.遼寧省本溪市桓仁滿族自治縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，桓仁滿族自治區(qū) 117200；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130122）

本研究利用大腸桿菌表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）Cap蛋白免疫家兔制備多克隆抗體，然后將其與FITC標(biāo)記羊抗兔二抗預(yù)混相互作用，制成預(yù)混液后與預(yù)固定樣品（病料或組織細(xì)胞）相互作用，通過熒光觀察檢測PCV2，建立了一步間接免疫熒光試驗(yàn)（one-step indirect immuno fl uorescence assay，OS-IIFA）。應(yīng)用OS-IIFA和PCR對廣東省各地豬場采集的79份病料樣品進(jìn)行檢測，陽性率分別為58.23%和69.62%，二者的陽性符合率為80%，陰性符合率為91.66%，總符合率為83.54 %，因此，該方法可作為PCV2流行病學(xué)調(diào)查及臨床監(jiān)測的有效手段。

豬圓環(huán)病毒2型；OS-IIFA；PCR；檢測

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，該病毒粒子無囊膜，呈二十面體對稱，直徑為14～25 nm，基因組為1.7 kb大小的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一[1,2]。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，將其分為PCV1和PCV2兩型[1,2]。1974年德國科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)PCV1為豬腎細(xì)胞系的一種污染物。雖然豬群中普遍存在PCV-1感染，但它無致病性，不能引起明顯的臨床癥狀[3]。而PCV2具有致病性，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），還是豬皮炎腎病綜合征（porcine dermatitisand nephropathy syndrome，PDNS）、豬呼吸道疾病復(fù)合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）及A2型先天性震顫（congenital tremor，CT）的主要病原[4,5]。同時(shí)有資料表明PCV2常與豬呼吸與繁殖綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）等病毒混合感染豬[6-8]。

近年來PCV相關(guān)疾病已嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。因此，建立一種操作簡便、成本低廉的快速檢測方法，有利于在實(shí)際生產(chǎn)和臨床中推廣，為PCV2的凈化和感染防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞、毒株與病料 克隆菌株DH5α感受態(tài)購自大連寶生物公司；表達(dá)菌株Rosetta感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；PK-15細(xì)胞為軍事獸醫(yī)研究所流行病學(xué)研究室保存；PCV2毒株、PRRSV cc-11株、PRV和豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；確定為PCV2，PRRSV、PRV和CSFV感染的陽性病料組織來自廣東省各地豬場79頭臨床發(fā)病豬的肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié)樣本，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；High Affinity Ni-Charged Resin蛋白純化親和層析柱購自GenScript公司；Biospin組織基因組DNA提取試劑盒購自BioFlux公司；D-氨基葡萄糖購自Sigma公司；Premix Taq?Version2.0（1.25 U/25 μL）、pMD18-T克隆載體、pET28b表達(dá)載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、（DL2000）DNA Marker均購自TaKaRa公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京索來寶科技有限公司。

1.3 免疫原的制備及PCV2 Cap多克隆抗體的制備

1.3.1 PCV2 Cap的原核表達(dá)與純化 根據(jù)PCV2全基因序列（GenBank登錄號：JQ809462.1），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并合成針對PCV2 Cap基因的引物（小寫部分為引入的酶切位點(diǎn)Nco I和Xho I），上、下游引物序列分別為：（CapF）5'- CTAGccatggA CAATGGCATCTTCAACACCCGC -3'和（CapR）5'- ACCGctcgagGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3'，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以PCV2細(xì)胞毒為模板，利用PCR技術(shù)將缺失核定位序列的ORF2基因片段克隆入pMD18-T載體，篩選獲得重組質(zhì)粒pMD18T-ORF2，經(jīng)NcoI、XhoI雙酶切后，回收ORF2基因，轉(zhuǎn)移入原核表達(dá)載體pET28b的相應(yīng)位點(diǎn)之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET28b-Cap。將重組質(zhì)粒pET28b-Cap轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Rosetta，經(jīng)終濃度為0.5 mmoL/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白用尿素變性處理后采用High Affinity Ni-Charged Resin蛋白純化親和層析柱純化，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.3.2 免疫程序及PCV2 Cap多克隆抗體的獲得 取高度純化的PCV2 Cap蛋白免疫新西蘭大耳白兔（購自長春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。首免：150 μg純化的Cap蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分混合乳化后，腹股溝及皮下多點(diǎn)注射；2周后用150 μg純化的Cap蛋白與弗氏不完全佐劑混合，腹股溝及后腿肌肉多點(diǎn)注射；4周后再次用200 μg純化的Cap與弗氏不完全佐劑的乳化物腹股溝及后腿肌肉多點(diǎn)注射。大量采血前3 d再次加強(qiáng)免疫，收集血清獲得PCV2 Cap多克隆抗體。間接ELISA檢測PCV2 Cap多克隆抗體水平。PCV2細(xì)胞毒適當(dāng)稀釋后包被ELISA反應(yīng)板，每孔100 μL，4℃過夜；5%脫脂奶封閉1 h；PCV2 Cap多克隆抗體1:500稀釋，37℃作用1 h；加入羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體1:5000稀釋，37℃作用1 h；加入OPD底物緩沖液，避光顯色10 min，加2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定OD490。

1.4 檢測引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV2全基因序列（GenBank登錄號：AF381175.1），設(shè)計(jì)合成1對特異性鑒定引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為702 bp。上、下游引物序列分別：（PCV2-F）5'-C GCCACCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACC-3'和（PCV2-R）5'- CGC TTAGGGTTTAAGTG GGGGGTCTTTA -3'，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用高壓滅菌超蒸水溶解配成10 pmol/μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒按使用說明提取病料組織總DNA，并利用合成的PCV2鑒定引物進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系：引物各0.5 μL（10 pmol/μL）、Premix Taq?Version2.0 ( 1.25 U /25μL)13 μL、DNA模板2 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，51℃退火30 s，72℃延伸50 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.5 PCV2一步間接免疫熒光試驗(yàn)（one-step indirect immuno fl uorescence assay, OS-IIFA）最佳工作條件的確定

1.5.1 固定液和固定時(shí)間的確定 以70%丙酮、80%丙酮、4%多聚甲醛、甲醇-丙酮固定液（1∶1）、100%丙酮做固定，再按照OS-IIFA操作步驟進(jìn)行，比較不同固定劑和固定時(shí)間的固定效果，確定最佳固定條件。

1.5.2 抗PCV2 Cap多抗和熒光二抗OS-IIF染色工作濃度的確定 使用以上述確定的適宜固定液作固定，帶毒細(xì)胞孔、正常細(xì)胞孔、感染豬組織涂片（來自同一個(gè)體的肝臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)制備一張涂片）、陰性豬組織涂片中分別加入不同稀釋度的抗PCV2 Cap多抗和陰性血清，血清稀釋度分別為1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1000；熒光二抗按說明書稀釋，將兩者等體積混合，與固定組織或細(xì)胞進(jìn)行一步染色試驗(yàn)，觀察比較抗PCV2 Cap多抗和熒光二抗稀釋度對試驗(yàn)結(jié)果的影響，確定最佳的抗PCV2 Cap多抗稀釋度、熒光二抗稀釋度和二者的最佳工作比例。

1.5.3 抗PCV2 Cap多抗和熒光二抗共同作用時(shí)間的確定 以上述確定的最佳稀釋度作為工作濃度， 分別以60、90、120、150 min 作為一抗和熒光二抗共同作用時(shí)間，比較不同作用時(shí)間對結(jié)果的影響，確定最佳的作用時(shí)間。

1.6 OS-IIFA敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

1.6.1 OS-IIFA特異性試驗(yàn) 分別將PCV2、PRRSV cc-11株、CSFV 感染細(xì)胞，確定為PCV2、PRRSV、CSFV感染的陽性病料組織涂片，進(jìn)行OSIIFA試驗(yàn)，觀察其有無特異性熒光，以確定該方法的特異性。空白對照以PBS代替一抗，觀察熒光二抗本身有無非特異性反應(yīng)。

1.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 相同批次的陽性血清和熒光二抗，在確定條件下在不同檢驗(yàn)批次對同批樣品進(jìn)行OS-IIFA試驗(yàn)，比較判定結(jié)果及熒光強(qiáng)弱的差別，以評價(jià)本方法的重復(fù)性。

1.7 OS-IIFA對臨床疑似PCV2豬組織樣品的檢測 應(yīng)用建立的一步間接免疫熒光技術(shù)檢測臨床疑似PCV2感染的病豬組織樣本（肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)），同時(shí)采用PCR方法對同一病料組織進(jìn)行病原學(xué)檢測。將OS-IIFA、PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)而分析OS-IIFA檢測方法的準(zhǔn)確性及檢測可靠性。

2 結(jié)果

2.1 免疫原的制備及PCV2 Cap多克隆抗體的制備

2.1.1 抗原蛋白PCV2 Cap的原核表達(dá)與純化 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28b-Cap經(jīng)雙酶切鑒定及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Rosetta，經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)前后的菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖1）。

鑒定正確后進(jìn)行大量誘導(dǎo)，采用High Affinity Ni-Charged Resin蛋白純化親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳分析顯示，獲得高純度的PCV2 Cap抗原蛋白（圖2）。Bradford法測定蛋白濃度為1.160 mg/mL。

2.1.2 抗PCV2 Cap多克隆抗體的制備 多次免疫后大量收集血清，獲得PCV2 Cap多克隆抗體。將PCV2 Cap多克隆抗體稀釋500倍，經(jīng)間接ELISA檢測OD490值為1.08。

圖1 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

圖2 重組蛋白pET28b-Cap純化后SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of puri fi ed recombinant pET28b-Cap proteins

2.2 一步間接免疫熒光試驗(yàn)最佳工作條件的確定

2.2.1 固定液和固定時(shí)間的確定 分別以70%丙酮、80 %丙酮、4%多聚甲醛、甲醇-丙酮固定液（1∶1）、100%丙酮作為固定液，分別固定5、10、20 min。根據(jù)涂片組織，細(xì)胞有無脫落、熒光強(qiáng)度與清晰度來比較，確定細(xì)胞采用70%丙酮作為固定液，固定時(shí)間10 min；病料組織涂片采用80 %丙酮作為固定液，固定時(shí)間20 min效果最佳。

2.2.2 抗PCV2 Cap多抗和熒光二抗OS-IIFA染色工作濃度的確定 以不同稀釋度的一抗和熒光二抗混合液進(jìn)行OS-IIFA染色，結(jié)果表明，抗PCV2 Cap多抗稀釋度在1:300～1:400之間陽性組織細(xì)胞內(nèi)有明亮綠色特異性熒光，與陰性細(xì)胞形成明顯的對比，非特異性熒光顆粒很少。再降低稀釋度時(shí)有少量的非特異性熒光顆粒，而再擴(kuò)大稀釋度時(shí)特異性熒光亮度和陽性細(xì)胞數(shù)量減少，熒光強(qiáng)度由明亮的黃綠色熒光變?yōu)榍逦^暗的熒光。

2.2.3 抗PCV2 Cap多抗和熒光二抗共同作用時(shí)間的確定 結(jié)果表明，抗PCV2 Cap多抗和熒光二抗混合液作用60 min與90 min無明顯差別。若作用超過120 min，則非特異性熒光顆粒增加，背景變亮，故一抗作用時(shí)間不宜采用120 min。在不影響結(jié)果判定的條件下，為了適應(yīng)快速診斷的需要，最終確定一抗和熒光二抗混合液作用時(shí)間采用60 min。

2.3 OS-IIFA敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.1 OS-IIFA敏感性、特異性試驗(yàn) 未發(fā)現(xiàn)其他病毒感染組織細(xì)胞與一抗之間有特異性的熒光，證明該方法具有很高的特異性。以PBS 代替抗PCV2 Cap多抗，進(jìn)行OS-IIFA試驗(yàn)，結(jié)果表明抗原與二抗之間無非特異性反應(yīng)，組織涂片視野內(nèi)呈深紅色背景。

圖3 不同病毒感染細(xì)胞的OS-IIFA檢測結(jié)果Fig.3 OS-IIFA results of cells infected with different viruses

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 對同一病料組織重復(fù)涂片，在相同條件下多次進(jìn)行OS-IIFA檢測，判定結(jié)果相同，重復(fù)性良好。

2.4 OS-IIFA檢測法的應(yīng)用

2.4.1 PCV2感染細(xì)胞OS-IIFA檢測 在24孔培養(yǎng)板中用10%PCV2同步接種PK-15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未接毒的正常細(xì)胞為陰性對照；維持培養(yǎng)72 h后，用70%丙酮固定10 min；棄丙酮，室溫晾干，加入用伊文斯藍(lán)-PBS稀釋的抗PCV2 Cap多抗和熒光抗體熒光混合液（一抗1:400稀釋，熒光二抗按說明書稀釋），37℃孵育60 min，用PBST（PBS pH7.2，0.05%Tween-20）洗滌3次，3 min/次；正常PK-15細(xì)胞作為陰性對照。熒光顯微鏡下觀察，感染PCV2細(xì)胞出現(xiàn)很特異的綠色熒光，熒光灶很清晰，細(xì)胞形態(tài)很好，細(xì)胞背景為暗紅色；未接毒的細(xì)胞無熒光，背景也是暗紅色，結(jié)果如圖3所示。

圖3 PCV2感染細(xì)胞的OS-IIFA檢測結(jié)果Fig.3 Detection of PCV2 in PK-15 cells by OS-IIFA

2.4.2 疑似PCV2感染病料的OS-IIFA檢測 將本實(shí)驗(yàn)室在廣東省各地豬場收集的79份疑似PCV2感染豬的腎臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié)樣本做涂片，用80%丙酮固定20 min；棄丙酮，室溫晾干，加入用伊文斯藍(lán)-PBS稀釋的抗PCV2 Cap多抗和熒光抗體熒光混合液（工作濃度：一抗1:300、熒光二抗按說明書稀釋），37℃孵育90 min，用PBST（PBS pH7.2，0.05% Tween-20）洗滌3次，3 min/次；同時(shí)設(shè)正常豬臟器組織作為陰性對照，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖4所示。

圖4 PCV2感染病料的OS-IIFA檢測結(jié)果Fig.4 OS-IIFA results of PCV2 in tissues from pigs

2.4.3 PCR檢測 使用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒，按說明提取79份疑似PCV2感染豬病料組織總的DNA， 用特異性鑒定引物進(jìn)行PCR檢測。0.9%瓊脂糖凝膠電泳可見PCR產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期702 bp符合。部分檢測結(jié)果如下圖5所示。

圖5 部分疑似PCV2感染病料PCR檢測結(jié)果Fig.5 The examination of suspicious PCV2-infected samples by PCR

2.4.4 OS-IIFA檢測與PCR檢測的符合試驗(yàn) 對79份疑似PCV2感染組織同時(shí)進(jìn)行OS-IIFA和PCR檢測。用OS-IIFA檢測有46份為陽性，33份為陰性；用PCR檢測55份為陽性，24份為陰性。這兩種方法總符合率為83. 54 %，其中陽性符合率為80% ，陰性符合率為91.66%。

3 討論

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的流行已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于PCV2感染所致的各種疾病的臨床表現(xiàn)與病理變化缺乏典型特征，因此這些疾病的臨床診斷十分困難，必須借助實(shí)驗(yàn)室手段才可以實(shí)現(xiàn)確診，因此迫切需要尋找合適的快速準(zhǔn)確的診斷方法，從根本上實(shí)現(xiàn)該病的防控和凈化[10]。

本研究建立了一種用于PCV2感染細(xì)胞和病料組織的OS-IIF檢測方法，該方法對傳統(tǒng)IIF進(jìn)行了優(yōu)化，用伊文斯藍(lán)-PBS稀釋的抗PCV2 Cap多抗和熒光抗體混合液進(jìn)行一步染色，使操作更加省時(shí)便捷。對79份疑似PCV2感染組織同時(shí)進(jìn)行OS-IIFA法和傳統(tǒng)IIF檢測，兩者一致率為100%（數(shù)據(jù)未列出），這表明PCV2 Cap多抗和熒光抗體預(yù)混作用存在非特異性結(jié)合的可能性較小，至少不會(huì)對結(jié)果的判定產(chǎn)生影響。在對臨床疑似PCV2感染病料的檢測應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)該檢測方法較適合對脾臟和腎臟組織的檢測，陽性樣品的檢出率較高，可能是由于脾臟和腎臟組織質(zhì)地較松軟，涂片、染色效果較好；PCR檢測陽性率較高的淋巴結(jié)組織是理論上病毒載量較高的組織，但因其質(zhì)地堅(jiān)硬不易制片，OS-IIFA的檢出率不及脾臟和腎臟。本研究中，PCR檢測方法直接以病料組織（經(jīng)充分研磨并反復(fù)凍融3次處理后）為模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測時(shí)陽性率僅為13.9%，需要對病料進(jìn)行全基因組提取后再進(jìn)行PCR，檢測陽性率為69.62%，相比OS-IIFA檢測方法耗時(shí)費(fèi)力，增加了檢測成本。同時(shí)PCR法敏感性高，常因非特異擴(kuò)增以及樣品交叉污染出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此在實(shí)際操作中對操作人員要求嚴(yán)格，試驗(yàn)過程要十分小心。本研究中兩種檢測方法的總體符合率可達(dá)83.54%，陽性符合率為80%，陰性符合率為91.66%，在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，結(jié)合技術(shù)和設(shè)備條件，選擇適宜的檢測方法或?qū)⑸鲜鰞煞N檢測方法結(jié)合應(yīng)用，做到早發(fā)現(xiàn)，早控制，為PCV2的防控提供技術(shù)支撐[11]。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF ONE-STEP INDIRECT IMMUNOFLUORESCENT ASSAY FOR DETECTION OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 INFECTION

GONG Ting1, HU Rong-liang2

(1. Huanren City Bureau of Livestock Product Safety Supervision, Huanren117200,China; 2. Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Military Academy of Medical Sciences, Institute of Military Veterinary, Changchun 130122, China)

In this study, the capsid protein of Porcine circovirus type 2(PCV2) was expressed in E.coli and used as antigen to immunize rabbits for preparation of polyclonal antibodies. Then the polyclonal antibodies were mixed and bound to the FITC conjugated goat antirabbit antibodies. The mixtures were applied to fixed samples（tissue slides and cells）. This one-step indirect immunofluorescence assay (OS-IIFA) developed here was used to detect the PCV2 antigen in 79 clinical samples collected from porcine farms in Guangdong province and compared with classical PCR method. As a result, the positive rates of these two methods were 58.23 % and 69.62 %,respectively, suggesting the OS-IIFA might be used for PCV2 epidemiology survey and diagnosis.

Porcine circovirus type 2; OS-IIFA; PCR; detection

S852.659.2

A

1674-6422（2017）05-0011-06

2016-11-08

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203056）

宮婷，女，碩士，主要從事畜產(chǎn)品安全檢驗(yàn)監(jiān)測

扈榮良，E-mail：Ronglianghu@hotmail.com