包旦奇，侯天龍，李澤君，劉芹防，張七斤

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

流感病毒M1與NA蛋白的相互作用及其在病毒出芽中的作用

包旦奇1，侯天龍2，李澤君2，劉芹防2，張七斤1

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

流感病毒是一種囊膜病毒，各組分在細(xì)胞質(zhì)膜組裝并以出芽形式釋放病毒。其中基質(zhì)蛋白1，即M1蛋白，對病毒的致病性和病毒粒子形態(tài)的穩(wěn)定起重要作用。NA蛋白是流感病毒的表面蛋白之一，可啟動病毒的出芽。M1蛋白和NA蛋白間是否存在相互作用，以及這種相互作用對病毒出芽的影響還存在未知。本研究利用雙分子熒光互補(bǔ)實驗證明M1蛋白與NA蛋白存在相互作用。利用體外出芽試驗發(fā)現(xiàn)單獨(dú)表達(dá)的M1蛋白不能出芽，而單獨(dú)表達(dá)的NA蛋白可以完成出芽；共表達(dá)NA與M1蛋白時，M1蛋白可以出芽，表明NA蛋白可以與M1蛋白發(fā)生互作并協(xié)助M1出芽。本研究探明了M1蛋白和NA蛋白的互作并揭示了這種互作在病毒出芽中的作用。

流感病毒；M1蛋白；NA蛋白；病毒出芽；雙分子熒光互補(bǔ)

流感病毒是一種負(fù)鏈RNA病毒，屬正黏病毒科，基因組分為8個片段，編碼至少10種蛋白，其中包括HA、NA、M2在內(nèi)的表面蛋白，3個RNA聚合酶蛋白PB2、PB1、PA，核蛋白NP，基質(zhì)蛋白M1以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2[1]。同時流感病毒也是一種囊膜病毒，其所有結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成后在病毒的出芽位點(diǎn)質(zhì)膜依次組裝，并最終依靠出芽的方式從感染的細(xì)胞擴(kuò)散[2]。這期間病毒的表面蛋白率先定位于細(xì)胞膜脂筏上的出芽位點(diǎn)啟動病毒出芽，其胞內(nèi)域與病毒內(nèi)部蛋白連接并組裝為完整的病毒顆粒，在表面蛋白的帶動下出芽，釋放到細(xì)胞外[3]。

基質(zhì)蛋白M1是一種多功能蛋白，在流感病毒中含量最多，同時與表面蛋白和內(nèi)部蛋白相互作用，在維持病毒結(jié)構(gòu)上起到重要作用，同時M1蛋白的基因型也決定病毒粒子的形狀是球狀還是絲狀[4,5]。M1蛋白在胞質(zhì)內(nèi)合成后通過其N端的核定位信號入核，之后與核糖核蛋白體復(fù)合物（viral ribonucleoprotein complexes，vRNP）及核輸出蛋白（nuclear export protein，NEP）形成復(fù)合體后出核[6]。有報道稱，在病毒的出芽過程中，M1不具備單獨(dú)出芽的能力，必須借助于出芽位點(diǎn)的其他蛋白協(xié)助出芽[7]，同時M1與vRNP的相互作用將vRNP帶至病毒出芽位點(diǎn)。此外，M1蛋白之間也可以相互作用，并在出芽位點(diǎn)形成多聚體，這是一種受控于M基因序列的相互作用，有助于在出芽時集中病毒組分的同時排除宿主成分[8]。

NA蛋白是一種二型跨膜糖蛋白，也是一種唾液酸酶，在病毒出芽早期定位于宿主細(xì)胞膜脂筏上的出芽位點(diǎn)，并促使細(xì)胞膜產(chǎn)生彎曲啟動出芽[7]。在病毒出芽晚期，發(fā)揮其唾液酸酶的功能，切斷細(xì)胞膜上與HA相互作用的唾液酸殘基，并幫助病毒從宿主細(xì)胞釋放[9]。

NA基因與M基因的搭配會影響流感病毒的致病性。2009年H1N1大流行毒株的NA基因與M基因來源于歐亞類禽毒株，研究證明，NA基因與M基因的搭配對其致病性有重要的作用[2]，但具體的機(jī)理尚不清楚。M基因可以表達(dá)M1與M2蛋白。研究顯示NA蛋白可能通過胞內(nèi)區(qū)域與病毒的內(nèi)部蛋白相互作用，但是具體的機(jī)制不清楚。本研究利用雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技術(shù)與出芽試驗對M1蛋白與NA的相互作用以及其在出芽中的作用進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 材料方法

1.1 細(xì)胞與毒株 293T細(xì)胞、A/WSN/1933（H1N1）病毒為本實驗室保存。

1.2 載體與主要試劑 VN、VC與3Flag真核表達(dá)載體為本實驗室保存；PCR試劑（Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Xho I與Not I、T4 DNA連接酶購自NEB公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、Opti-MEM購自Gibco公司；凝膠回收試劑盒（QIA quick Gel Extraction Kit）購自北京華綠源科技有限公司；大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒購自QIAGEN公司；轉(zhuǎn)染試劑Mirus購自Bio公司。

1.3 雙分子熒光互補(bǔ)實驗

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建 使用RNA提取試劑盒提取流感病毒基因組RNA后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用，利用已設(shè)計好的特異性引物PCR擴(kuò)增M1與NA基因片段。將擴(kuò)增好的M1片段克隆入BiFC系統(tǒng)工作質(zhì)粒VC（酶切位點(diǎn)為Xho I與Not I），構(gòu)建VC-M1質(zhì)粒。已擴(kuò)增的NA片段克隆至BiFC工作質(zhì)粒VN（酶切位點(diǎn)為Xho I與Not I），命名為VN-NA。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用腔室載玻片培養(yǎng)293T細(xì)胞，20 h后用PBS清洗細(xì)胞，將已構(gòu)建的BiFC系統(tǒng)質(zhì)粒VC-M1與VN-NA質(zhì)粒（0.1 μg/質(zhì)粒）均勻混合于50 μL Fresh-opti-MEM，每孔每質(zhì)粒200 ng，并使用Mirus轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞固定、染色與觀察 轉(zhuǎn)染20 h后吸去細(xì)胞上清，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min；吸去多聚甲醛固定液，并用0.1%Triton X-100透化處理細(xì)胞10 min，棄去透化液，用DAPI染料對細(xì)胞染色5 min，吸去DAPI染料后PBS清洗細(xì)胞；最后在載玻片上滴加封片液，蓋上蓋玻片完成封片，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.4 出芽試驗

1.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建 將已擴(kuò)增的M1片段利用酶切位點(diǎn)Xho I與Not I克隆到3Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒（3Flag-M1），而NA片段克隆于帶2ha標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒，稱為2ha-NA。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將293T細(xì)胞于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)20 h后用PBS清洗細(xì)胞，并分別將2ha-NA質(zhì)粒與質(zhì)粒3Flag-M1（2 μg/質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.4.3 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）的純化 轉(zhuǎn)染后48 h分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞，將細(xì)胞上清室溫2000×g離心30 min后吸取上清，4℃、288 000×g超速離心5 h后，將沉淀溶解于100 μL PBS中，－80℃凍存?zhèn)溆?。?xì)胞用1 mL RIPA裂解液在培養(yǎng)皿上4℃裂解10 min后，將細(xì)胞和裂解液收集至1.5 mL離心管，4℃放置20 min后4℃、13 201×g離心20 min，收集裂解液于新的1.5 mL離心管中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 Western blot 分別取上述收集的細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液10 μL，各自加入2.5 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，95℃煮10 min后上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE，之后轉(zhuǎn)膜于硝酸纖維素膜。使用5%脫脂奶粉PBS溶液封閉12 h后PBS清洗3次，每次10 min。一抗（Monoclonal ANTI-FALG、Monoclonal Anti-HA antibody，購自SIGMAALDRICH）和二抗(Goat Anti Mouse IgG，購自Jackson Immuno Research)分別溶解于3%脫脂奶粉PBS溶液（一抗終濃度為1 μg/mL，二抗終濃度為0.5 μg/mL），先后對膜孵育1 h，每次孵育后用PBS清洗3次，每次10 min。最后ECL孵育5 min，顯影儀下顯影觀察。

2 結(jié)果

2.1 M1蛋白與NA蛋白相互作用 通過雙分子熒光互補(bǔ)實驗（BiFC）來研究基質(zhì)蛋白M1和NA的相互作用。將VN-NA和VC-M1兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了較強(qiáng)的綠色熒光，說明NA蛋白和M1蛋白之間存在較強(qiáng)的相互作用（圖1）。

2.2 單獨(dú)表達(dá)的M1蛋白不能完成出芽 為了進(jìn)一步研究M1的體外出芽能力，我們將3Flag-M1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞上清，進(jìn)行VLPs的純化，將純化好的VLPs與細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，M1蛋白在293T細(xì)胞可以成功被表達(dá)，但是在純化的VLPs中檢測不到M1蛋白，說明單獨(dú)表達(dá)的M1蛋白沒有出芽能力，不能完成體外出芽（圖2）。

圖1 利用BiFC檢測M1蛋白與NA蛋白在293T細(xì)胞中的相互作用Fig.1 Interaction between M1 and NA protein in 293T cell by using BiFC system

圖2 VLPs和293T細(xì)胞中M1蛋白的Western blot檢測Fig.2 Western blot for M1 protein in VLPs and transfected 293T cell

2.3 單獨(dú)表達(dá)的NA蛋白可以完成體外出芽 為了進(jìn)一步研究NA蛋白的體外出芽能力，我們將2ha-NA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞上清，進(jìn)行VLPs純化，對純化好的VLPs與細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，NA蛋白在293T細(xì)胞可以成功被表達(dá)，而且純化的VLPs中可以檢測到高水平的NA蛋白，說明單獨(dú)表達(dá)的NA蛋白具有出芽能力，可以完成體外出芽。

圖3 VLPs和293T細(xì)胞中NA蛋白表達(dá)的Western blot檢測Fig.3 Expression analysis of NA protein in VLPs and transfected 293T cell by Western blot

2.4 NA蛋白可以幫助M1蛋白出芽 BiFC實驗證實NA蛋白與M1蛋白存在相互作用，但是這種相互作用在病毒出芽中的作用不清楚。為了研究此相互作用對NA與M1蛋白出芽的影響，我們將3Flag-M1、2ha-NA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞上清進(jìn)行VLPs分離，對VLPs與細(xì)胞分別進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示M1蛋白和NA蛋白在細(xì)胞內(nèi)成功被表達(dá)，而且在純化過的VLPs中，可以同時檢測到M1與NA蛋白。由于體外單獨(dú)表達(dá)的M1蛋白不能完成出芽，但是與NA蛋白共表達(dá)時M1可以出芽，說明具有出芽能力的NA蛋白通過相互作用可協(xié)助M1蛋白出芽。

圖4 M1蛋白與NA蛋白體外出芽情況Fig.4 Budding of M1 protein and NA protein in cotransfected 293T cells

3 討論

流感病毒作為一種人畜共患病的病原，在國內(nèi)外都受到高度重視。目前在H1N1流感病毒出芽機(jī)制方面的研究不多。M1蛋白是一種多功能蛋白，在VLPs中的含量最多，它不僅能夠與vRNPs相互作用影響其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，還具有影響病毒粒子形態(tài)等諸多功能，對流感病毒的復(fù)制有重要作用。但是對M1蛋白在流感病毒出芽過程中的作用只有少量研究，M1蛋白在病毒出芽模型中的一些關(guān)鍵問題（如M1蛋白是否可單獨(dú)出芽還是必需被攜帶出芽，M1蛋白與表面蛋白的相互作用區(qū)域等）尚不清楚[8,10]。

對于M1蛋白的出芽能力，有研究證明體外單獨(dú)表達(dá)的M1蛋白具有出芽能力，可以獨(dú)自完成出芽，而另外一些研究結(jié)果顯示單獨(dú)表達(dá)的M1蛋白由于沒有膜結(jié)合區(qū)域，不能獨(dú)自完成出芽[8,10]。本研究利用體外出芽實驗證明M1并不具備單獨(dú)出芽的能力，在病毒出芽過程中，M1蛋白必須與病毒表面蛋白的胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合，并被攜帶出芽。不同于M1，作為表面蛋白的NA可以單獨(dú)出芽。雙分子熒光互補(bǔ)實驗和病毒體外出芽實驗結(jié)果顯示M1蛋白和NA蛋白之間存在較強(qiáng)的相互作用，也正是這種相互作用幫助M1蛋白出芽。本研究證明了流感病毒M1蛋白與NA蛋白存在相互作用，揭示了他們之間相互作用在流感病毒復(fù)制中的作用，下一步可鑒定M1與NA相互作用的功能區(qū)域，以期為新型抗流感病毒藥物研發(fā)和相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

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INTERACTION OF M1 WITH NA PROTEIN OF INFLUENZA VIRUS AND ITS ROLE IN VIRUS BUDDING

BAO Dan-qi1, HOU Tian-long2, LI Ze-jun2, LIU Qin-fang2, ZHANG Qi-jin1

(1.Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

In fl uenza virus is an enveloped virus, which assemblies at cytoplasm membranes and is released from host cells by budding.The matrix protein (M1) involves in the pathogenicity and morphological integrity of influenza virus. The surface NA protein of in fl uenza virus plays a critical role in the initial stage of virus budding. Several studies have provided evidence for interaction of M1 with NA. However, the function of this interaction in virus budding remains unclear. In the present study, bimolecular fluorescence complementation(BiFC) experiments were conducted to investigate the interaction between M1 and NA. The VLP assay showed that overexpressed NA budded by itself but M1 did not. However, M1 budded when co-expressed with NA. This study revealed the interaction between M1 and NA proteins and its function in virus budding of in fl uenza virus.

In fl uenza virus; M1 protein; NA protein; budding; bimolecular fl uorescence complementation(BiFC)

S852.659.5

A

1674-6422（2017）05-0001-04

2016-12-26

國家自然科學(xué)基金面上項目（31572543）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(2016JB13)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才項目

包旦奇，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

張七斤，E-mail：nmgzqj@126.com；劉芹防，E-mail：liuqinfang@shvri.ac.cn