李 姝，邵 毅*，周昌艷*，王 華，邢增濤，趙志輝

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，上海 201403；3.美國俄亥俄州立大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)系，美國 俄亥俄 哥倫布 43210；4.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院微生物系，上海 200433；5.上海市農(nóng)業(yè)委員會，上海 200003）

市售雞肉及內(nèi)臟中磺胺耐藥菌污染特征

李 姝1,2，邵 毅2,*，周昌艷2,*，王 華3,4，邢增濤1,5，趙志輝2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，上海 201403；3.美國俄亥俄州立大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)系，美國 俄亥俄 哥倫布 43210；4.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院微生物系，上海 200433；5.上海市農(nóng)業(yè)委員會，上海 200003）

為評價抗生素耐藥基因通過市售雞肉產(chǎn)品進行遷移的風(fēng)險，從上海5 個大型超市和綜合市場采集的9 個雞肉樣品和4 個內(nèi)臟樣品中分離對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶不敏感的細菌（Sul/Trir），研究其耐藥特征，并用Southern雜交對耐藥基因進行定位。結(jié)果表明，所有樣品均分離到了Sul/Trir菌，菌落數(shù)為2.0×102～1.0×107CFU/g，占總可培養(yǎng)菌的1.42%～82.00%。297 株Sul/Trir菌的多重耐藥現(xiàn)象普遍，耐藥基因sul1、sul2、tetA、tetB、tetC、tetE、tetG、tetL、tetM和intI的檢出率分別為11.33%、32.81%、6.64%、12.89%、2.73%、6.25%、9.38%、18.75%、39.84%和28.52%。耐藥基因的寄主菌包括Escherichia sp.、Pedobacter sp.、Staphylococcus sp.、Enterococcus sp.、Sphingobacterium sp.和Acinetobacter sp.等，大多數(shù)的磺胺最小抑菌濃度大于512 μg/mL，其中一株葡萄球菌的質(zhì)粒上有sul2基因。綜上，耐藥菌和耐藥基因可能通過市售雞肉及內(nèi)臟產(chǎn)品進行遷移。

磺胺耐藥菌；耐藥基因；雞肉；內(nèi)臟

細菌中抗生素耐藥性的快速攀升已成為威脅全球健康的一大問題[1]，耐藥基因通過食物鏈遷移至人類共生菌是其中一種重要的途徑[2]?？股氐牟划斒褂檬沟灭B(yǎng)殖場成為耐藥菌產(chǎn)生和增殖的重要場所[3-4]，進而，肉產(chǎn)品中的耐藥菌可能通過加工、零售等環(huán)節(jié)進一步污染、擴散[5]。因此，肉產(chǎn)品中殘留微生物的抗生素耐藥性問題尤其值得關(guān)注。在我國，多種禽源致病菌已具有多重耐藥性[6-8]，但耐藥性的發(fā)生和遷移機制尚未揭示，亟需探明雞肉及相關(guān)產(chǎn)品中耐藥菌的污染特征和耐藥基因的遷移風(fēng)險。

現(xiàn)有的耐藥性研究多集中于（條件性）致病菌，關(guān)于非致病菌的耐藥數(shù)據(jù)十分有限。數(shù)量龐大的非致病菌是耐藥基因的供體、受體和中間載體[9]，甚至?xí)龠M耐藥基因的水平遷移[10]，在抗生素耐藥性的遷移過程中扮演了關(guān)鍵角色。因此，在非致病菌范圍內(nèi)研究抗生素耐藥性污染特征，是揭示耐藥性發(fā)生和遷移機制，進而提出耐藥性遷移的控制措施的基礎(chǔ)和新途徑。本研究以市售雞肉和內(nèi)臟產(chǎn)品為對象，研究了非致病磺胺耐藥菌的污染水平、耐藥特性、耐藥基因攜帶情況及潛在的遷移風(fēng)險，以期為肉雞養(yǎng)殖中的抗生素管理、初加工過程的微生物控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮整雞、雞腿、雞翅和雞爪共9 份樣品以及雞胗和雞腸共4 份樣品購自上海市奉賢區(qū)和閔行區(qū)5 個大型超市和綜合菜場。樣品采集后用冰包保存，3 h內(nèi)運回實驗室進行耐藥菌的分離。

腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）瓊脂培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，Sul）、甲氧芐啶（trimethoprim，Tri）、四環(huán)素（tetracycline，Tet）、強力霉素（doxycycline，Dox）、頭孢噻肟（cefotaxime，Ctx）、紅霉素（erythromycin，Erm）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacine，Cip） 美國Sigma公司；真菌抑制劑放線菌酮（cycloheximide，Cyc） 美國Amresco公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、耐藥基因克隆試劑、質(zhì)粒提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DIG DNA Labeling and Detection Kit瑞士羅氏公司。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜 美國Thermo公司；恒溫培養(yǎng)箱德國Friocell公司；PCR儀、核酸電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；全自動凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日公司；勻漿機法國Interscience公司。

1.3 方法

1.3.1 磺胺耐藥菌的分離、計數(shù)和多耐表型的初步分析

根據(jù)Wang Hua等[2]的方法從樣品中分離對Sul不敏感的細菌并按標準方法計數(shù)：無菌條件下將樣品剪碎，混勻，準確稱量25 g于無菌袋中，用225 mL無菌生理鹽水均質(zhì)10 min，10 倍梯度稀釋，每個稀釋度取200 μL均勻涂布于含有152 μg/mL Sul、8 μg/mL Tri和100 μg/mL Cyc的BHI瓊脂培養(yǎng)基上，或僅含有100 μg/mL Cyc的BHI瓊脂培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)48 h，分別進行磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥菌（Sul/Trir）和總可培養(yǎng)菌的菌落計數(shù)[11]。

根據(jù)Huang Ying等[12]的方法對分離獲得的Sul/Trir菌進行多耐表型的初步分析：每個樣品選取多至25 個形態(tài)不同的Sul/Trir菌，共256 株，用滅菌牙簽接種至含16 μg/mL Tet、10 μg/mL Erm、4 μg/mL Ctx、16 μg/mL Dox或4 μg/mL Cip的BHI平板上，32 ℃培養(yǎng)48 h，記錄其在含各種抗生素的平板上的生長情況。

1.3.2 耐藥基因的篩查及菌種鑒定

表1 耐藥基因、整合子酶基因和16S rRNA引物Table 1 Primers of antibiotic resistance genes, integron gene and 16S rRNA gene

用pEASY-T3載體克隆9 個耐藥基因sul1、sul2、tetA、tetB、tetC、tetE、tetG、tetL、tetM和一類整合子酶基因intI，在256 株Sul/Trir菌中用PCR法篩查上述基因[4]，隨機選取10%的陽性PCR產(chǎn)物進行測序確認[12]。對含有至少3 個耐藥基因的菌株進行后續(xù)藥敏實驗，并進行16S rRNA PCR后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列用NCBI BLAST比對初步鑒定菌種。PCR引物見表1。

1.3.3 Sul/Trir菌的Sul/Tri MIC的測定

用美國臨床與實驗室標準化研究所推薦的微量肉湯稀釋法[19]對含有至少3 個耐藥基因的Sul/Trir菌進行Sul/Tri的最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定。以BHI培養(yǎng)基替代肉湯培養(yǎng)基[12,17]，以葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213作為質(zhì)控菌株。

1.3.4 耐藥基因sul的Southern雜交及含有耐藥基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

含有耐藥基因的菌株用堿裂解法提取質(zhì)粒后，按照DIG DNA Labeling and Detection Kit的操作流程稍加改動后進行耐藥基因的Southern雜交[20]。地高辛標記探針制備中，用本實驗室構(gòu)建并測序的sul1-pEASY-T3質(zhì)粒和sul2-pEASY-T3質(zhì)粒作為模板，區(qū)別于試劑盒操作步驟中的隨機標記法。

提取用Southern雜交初步鑒定的含有耐藥基因的質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細胞中[21]，在含有152 μg/mL Sul和8 μg/mL Tri的LB培養(yǎng)基上篩選陽性菌株，并按1.3.3節(jié)的方法測定Sul/Tri的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 磺胺耐藥菌計數(shù)和多耐表型

圖1 市售雞肉及內(nèi)臟產(chǎn)品中可培養(yǎng)細菌總數(shù)和Sul/Trir菌總數(shù)Fig. 1 Prevalence of total cultivable bacteria and Sul/Trir bacteria in chicken and giblet samples

13 個樣品的總可培養(yǎng)菌數(shù)量差異較大，但均分離到了耐藥菌Sul/Trir，菌落數(shù)為2.0×102～1.0×107CFU/g。69.23%的樣品中Sul/Trir菌的數(shù)量高于104CFU/g，有3 個雞腿樣品（圖1，1～3號樣品）和1 個整雞樣品（圖1，7號樣品）的Sul/Trir菌數(shù)量甚至達到了106CFU/g的水平。9 個雞肉樣品中，Sul/Trir菌占總可培養(yǎng)菌的比例為1.42%～70.42%，4 個內(nèi)臟樣品的這一比例為13.74%～82.00%。因此，市售雞肉及內(nèi)臟樣品中普遍存在Sul/Trir菌。

圖2 多重耐藥菌的比例Fig. 2 Proportions of multi-drug resistant bacteria

分離到的256 株Sul/Trir菌中，多重耐藥現(xiàn)象普遍：91.58%的菌至少對2 種抗生素不敏感，近1/4的菌對全部6 種抗生素均不敏感（圖2）。內(nèi)臟樣品中分離的Sul/Trir菌的多重耐藥性較雞肉樣品更為普遍，77.17%的菌至少對5 種抗生素不敏感。除Sul/Tri外，256 株菌對Tet、Dox、Erm、Ctx和Cip的耐藥率分別為87.21%、68.69%、68.69%、64.31%和48.82%。

2.2 Sul/Trir菌的MIC、耐藥基因和菌種鑒定

在256株Sul/Trir菌中篩查9 個耐藥基因和一類整合子酶基因intI，結(jié)果表明，sul1、sul2、tetA、tetB、tetC、tetE、tetG、tetL、tetM和intI的檢出率分別為11.33%、32.81%、6.64%、12.89%、2.73%、6.25%、9.38%、18.75%、39.84%和28.52%。同時含有至少3 個耐藥基因的菌有15 株（表2），包括5 株埃希氏菌（Escherichia sp.，其中4 株為大腸桿菌）、4 株土地桿菌（Pedobacter sp.）、2 株葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、2 株腸球菌（Enterococcus sp.）、1 株鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp.）和1 株不動桿菌（Acinetobacter sp.）。這些菌株顯示了對Sul/Tri較強的耐藥性，12 株菌（80%）的磺胺MIC值大于512 μg/mL。Sul/Trir菌的耐藥特性表明，市售雞肉和內(nèi)臟產(chǎn)品中的細菌包含了多種耐藥基因，且對Sul/Tri的耐藥程度較高。

2.3 耐藥基因的定位

圖3 Rci1號樣品的質(zhì)粒（a）和sul2基因Southern雜交結(jié)果（b）Fig. 3 Plasmid of Rci1 (a) and Southern blot analysis of sul2 gene (b)

用Southern雜交研究耐藥基因sul1和sul2的定位，結(jié)果表明，本研究中的Rci1號樣品Sul/Trir菌的質(zhì)粒上可能存在sul2基因（圖3）。提取Rci1號樣品Sul/Trir菌的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5-α中，Sul/Tri對陽性菌株的MIC大于256 μg/mL，而對原始DH5-α的MIC小于4 μg/mL。因此認為Rci1號樣品的Sul/Trir菌中，質(zhì)粒上含有sul2基因，存在sul2基因隨質(zhì)粒在不同菌種間遷移擴散的可能性。所有菌株的質(zhì)粒上未發(fā)現(xiàn)sul1基因（結(jié)果未顯示）。

3 討 論

已有報道表明，我國的生鮮雞肉中沙門氏菌等致病菌對磺胺類抗生素具有較高的耐藥性[22]，本研究則表明，生鮮雞肉和內(nèi)臟產(chǎn)品中的細菌包含了大量磺胺耐藥基因sul1和sul2，具有磺胺耐藥表型的細菌數(shù)量和占總菌的比例高于同類產(chǎn)品中的四環(huán)素耐藥菌[17]或其他產(chǎn)品的Sul/Trir菌[20]，且對Sul/Tri的耐藥程度較高，可見肉雞養(yǎng)殖和初加工鏈中細菌的磺胺耐藥性普遍存在。盡管雞肉和內(nèi)臟產(chǎn)品往往需要高溫烹飪才能食用，這一深加工過程能基本消除耐藥菌的威脅，但從養(yǎng)殖、宰殺、零售到消費者初加工的整個過程中，耐藥菌仍有可能通過直接接觸[5]等方式進行擴散、威脅人類健康。因此探明Sul/Trir菌的產(chǎn)生和留存機制及耐藥性向人類的遷移潛勢，是確保雞肉產(chǎn)品安全性的重要基礎(chǔ)。本研究的雞肉和內(nèi)臟樣品中Sul/Trir菌普遍存在，并從中篩查到了攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，但16 種磺胺類抗生素[23]的檢出率和殘留量均很低（數(shù)據(jù)未顯示），說明雞肉和內(nèi)臟中Sul/Trir菌的穩(wěn)定存活并不依賴于抗生素篩選壓，因此，限制肉雞養(yǎng)殖中抗生素的使用并不一定減少肉雞產(chǎn)品中微生物的耐藥性[24]，其耐藥機制值得深入研究。除sul基因外，樣品中還發(fā)現(xiàn)了多種tet基因，tetM和tetL的檢出率較高，與前人研究結(jié)果相似[25-26]，因此，雞肉產(chǎn)品中四環(huán)素耐藥菌的污染特征也需要全面地評估。

近年來，由接合性質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transmission，HGT）被多次證明是耐藥基因遷移擴散的重要機制之一[27-28]，HGT與耐藥基因池的大小、耐藥基因供體/受體的遺傳背景是否相近等均有關(guān)系[29]，因此，在數(shù)量上遠超致病菌且遺傳背景多樣化的非致病菌中，耐藥基因的含量和遷移頻率可能更高。本研究分離獲得的Sul/Trir菌中檢出了大量耐藥基因，說明市售雞肉和內(nèi)臟產(chǎn)品上的微生物曾經(jīng)可能并且未來也可能進一步涉及耐藥基因的水平遷移；在其中一株對Sul/Tri具有耐藥性的葡萄球菌中，發(fā)現(xiàn)耐藥基因sul2位于質(zhì)粒上，且該質(zhì)粒存在向其他細菌進行水平遷移的潛在風(fēng)險。此外，有證據(jù)表明，腸球菌在HGT中的敏感性較高，在耐藥基因在微生物系統(tǒng)內(nèi)的遷移中扮演了重要的角色[30]。而本研究在市售雞肉和雞腸樣品中均分離到了含有多個耐藥基因的腸球菌，也指示了耐藥基因發(fā)生遷移的風(fēng)險性。

綜上，市售雞肉及內(nèi)臟樣品中Sul/Trir菌分布廣泛，普遍具有多重耐藥性，且含有大量耐藥基因，存在耐藥基因隨質(zhì)粒在細菌間水平遷移的潛在風(fēng)險。需要深入研究雞肉產(chǎn)品中Sul/Trir菌存在并維持的機制，評估磺胺耐藥基因向人類共生菌遷移的風(fēng)險。

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Prevalence and Characteristics of Sulfamethoxazole Resistant Bacteria in Retail Chicken Meat and Giblets

LI Shu1,2, SHAO Yi2,*, ZHOU Changyan2,*, WANG Hua3,4, XING Zengtao1,5, ZHAO Zhihui2

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China; 3. Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, Columbus 43210, USA; 4. Department of Microbiology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China; 5. Shanghai Agriculture Committee, Shanghai 200003, China)

In order to investigate the potential risk of retail chicken products in transmitting antibiotic resistance (AR)encoding genes, sulfamethoxazole/trimethoprim resistant (Sul/Trir) bacteria were isolated from 13 chicken products,including nine chicken meat samples and four giblet samples, purchased from five supermarkets and local markets. The Sul/Trirresistance genes were mapped by Southern blot analysis. Sul/Trirbacteria were detected in all chicken samples.The prevalence of Sul/Trirbacteria ranged from 2.0 × 102CFU/g to 1.0 × 107CFU/g, accounting for 1.42%-82.00% of the total cultivable bacteria. Multi-drug resistance was observed for all 297 Sul/Tririsolates, and the positive rates of AR genes including sul1, sul2, tetA, tetB, tetC, tetE, tetG, tetL, tetM and intI were 11.33%, 32.81%, 6.64%, 12.89%, 2.73%, 6.25%,9.38%, 18.75%, 39.84% and 28.52% respectively. Escherichia sp., Pedobacter sp., Staphylococcus sp., Enterococcus sp.,Sphingobacterium sp. and Acinetobacter sp. were identified as hosts for AR genes. The minimum inhibitory concentration(MIC) of Sul for most isolates was higher than 512 μg/mL. Furthermore, a plasmid harboring sul2 gene was found in one Sul/Tririsolate by Southern blot hybridization. In conclusion, retail chicken products can be a potential avenue transmitting antibiotic resistant bacteria and AR genes.

sulfamethoxazole/trimethoprim resistant bacteria; antibiotic resistance genes; chicken meat; giblets

10.7506/spkx1002-6630-201721027

TS201.3

A

1002-6630（2017）21-0170-05

2017-03-13

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31401599）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（應(yīng)用基礎(chǔ)類）（滬農(nóng)科攻字（2014）第7-3-6號）；上海市青年科技英才揚帆計劃項目（14YF1413000）；美國外交部國際教育協(xié)會美英聯(lián)合全球創(chuàng)新倡議（GII）項目（GRT00033913）

李姝（1990—），女，碩士研究生，研究方向為肉產(chǎn)品耐藥菌。E-mail：slishu@163.com

*通信作者：邵毅（1982—），女，副研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品耐藥菌。E-mail：shao_saas@163.com周昌艷（1969—），女，研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：changyanz@sina.com

李姝, 邵毅, 周昌艷, 等. 市售雞肉及內(nèi)臟中磺胺耐藥菌污染特征[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 170-174.

10.7506/spkx1002-6630-201721027. http://www.spkx.net.cn

LI Shu, SHAO Yi, ZHOU Changyan, et al. Prevalence and characteristics of sulfamethoxazole resistant bacteria in retail chicken meat and giblets[J]. Food Science, 2017, 38(21): 170-174. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721027. http://www.spkx.net.cn