王 晉，王虹元，金玲玲，郭長祿，張治洲*

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264200）

乙醇對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及其分子機(jī)理

王 晉，王虹元，金玲玲，郭長祿，張治洲*

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264200）

以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為模式生物，在其生長培養(yǎng)基中分別添加4、40、400 mmol/L的乙醇試劑，觀察乙醇對線蟲壽命的調(diào)控作用。通過檢測對照組和喂食乙醇溶液實(shí)驗(yàn)組線蟲體內(nèi)壽命相關(guān)基因（age-1、pdk-1、akt-1、let-363）的表達(dá)差異，探究乙醇調(diào)控線蟲壽命的分子機(jī)制。結(jié)果表明，喂食400 mmol/L乙醇可有效提高線蟲壽命，分別將壽命中位數(shù)和平均壽命提高了11.76%和15.78%，且與對照組相比均具有顯著性差異（P＜0.05）。利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測基因表達(dá)，結(jié)果表明乙醇可能通過抑制age-1基因表達(dá)，引發(fā)胰島素信號傳導(dǎo)通路中一系列相應(yīng)下游基因表達(dá)變化從而延長線蟲壽命；雷帕霉素受體信號傳導(dǎo)通路中l(wèi)et-363基因也因乙醇的攝入及胰島素信號傳導(dǎo)通路下游基因的抑制作用而表達(dá)下降，兩者聯(lián)合達(dá)到顯著延長線蟲壽命的作用效果。

秀麗隱桿線蟲；長壽；乙醇；信號傳導(dǎo)通路

隨著社會的進(jìn)步和科技的迅猛發(fā)展，通過藥物和食品延緩衰老在技術(shù)水平上成為可能。生物體的壽命長短如何受外來因素的影響？衰老的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制到底是什么？隨著胰島素信號（insulin/IGF signalling，IIS）和雷帕霉素受體信號（mammalian target of rapamycin，mTOR）等傳導(dǎo)通路對衰老調(diào)控作用的機(jī)制被一一解開，衰老研究在分子生物學(xué)上取得突破性進(jìn)展，并成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題[1-2]?；虻耐蛔兡軌蚴股矬w壽命發(fā)生顯著改變，如daf-2基因突變體線蟲壽命是正常線蟲壽命的2～3 倍，而daf2/clk-1雙基因突變體線蟲壽命可提高5～6 倍[3]，Insulin/IGF-1通路相關(guān)基因突變會使實(shí)驗(yàn)動物衰老表征得到大幅度改善[4]。然而壽命的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，除了受到遺傳的控制之外，也與人類的生存環(huán)境和生活習(xí)慣息息相關(guān)。由于秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）具備生命周期短、在實(shí)驗(yàn)室易于培養(yǎng)且易于操作、繁殖快、容易獲取大量同期化樣本以消除個體差異等優(yōu)勢[5-6]，因此選用秀麗隱桿線蟲作為壽命研究的模式生物。

以乙醇為主要成分的酒類飲料是中國人在社交、慶典等活動中不可缺少的特殊飲品，在日常生活中也占有十分重要的地位。我國自古便有“酒乃百藥之長”一說，這是古人對酒的高度評價(jià)。可以說酒在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用是祖國醫(yī)藥學(xué)的發(fā)明之一，酒有“通血脈、散濕氣”、“行藥勢、殺百邪惡毒氣”、“除風(fēng)下氣”、“開胃下食”、“溫腸胃、御風(fēng)寒”、“止腰膝疼痛”等功效，而且在行醫(yī)的過程中將酒入藥可推進(jìn)藥效發(fā)揮[7]。在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)乙醇作為酒中的主要成分具有一定的增壽作用：2011年于笑坤[8]發(fā)現(xiàn)在低乙醇體積分?jǐn)?shù)（1%～2%）的刺激之下，線蟲壽命有所延長而且爬行速度較快。而2012年美國加州大學(xué)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)L1期線蟲幼蟲通過攝食乙醇（體積分?jǐn)?shù)0.4%）并將其轉(zhuǎn)化為脂肪酸而達(dá)到增壽作用[9]。

為了進(jìn)一步探究攝食乙醇可顯著延長秀麗隱桿線蟲壽命的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以N2野生型秀麗隱桿線蟲作為模式生物，通過喂食4、40、400 mmol/L 3 種不同濃度乙醇，觀察乙醇對其壽命的影響，從IIS和mTOR兩個經(jīng)典的衰老調(diào)控信號傳導(dǎo)通路中選擇壽命相關(guān)基因（age-1、pdk-1、akt-1和let-363）（表1）。其中age-1、pdk-1、akt-1基因是IIS傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因，其對生物體表型的作用已被報(bào)道：與個體壽命、抗逆性、生育和胚胎發(fā)育都具有明顯相互關(guān)聯(lián)[10-11]；mTOR傳導(dǎo)通路中的let-363基因?yàn)樯飩€體新陳代謝關(guān)鍵基因，通過調(diào)控生物個體新陳代謝速率影響個體壽命的長短[12-13]。目前尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道上述4 個基因的表達(dá)是否受乙醇的影響。通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測第8天和第12天線蟲體內(nèi)age-1、pdk-1、akt-1和let-363的表達(dá)情況，進(jìn)而初步判斷乙醇對壽命的調(diào)控作用與IIS和mTOR兩個經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路之間的關(guān)系。

表1 4 個與線蟲壽命相關(guān)基因的基本信息Table 1 Information about lifespan-related genes in C. elegans

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N2野生型秀麗隱桿線蟲（C. elegans，the Bristol strain N2）和大腸桿菌（Escherichia coli）OP50由天津科技大學(xué)王昌祿教授惠贈。

乙醇（100%）等試劑均購于上海生物（工程）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z等系列生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-1F型單人雙面垂直潔凈工作臺 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；XYH-2A型連續(xù)變倍體式顯微鏡 上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司；TDL-60B/16B型臺式離心機(jī) 上海安亨科學(xué)儀器廠；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Stepone實(shí)時熒光定量PCR儀美國ABI生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 線蟲培養(yǎng)基的配制

稱量3 g NaCl、2.5 g胰蛋白胨、17 g瓊脂粉，添加ddH2O至1 L，121 ℃高溫高壓滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃時逐一添加CaCl2（1 mol/L）1 mL、MgSO4（1 mol/L）1 mL、KPO4緩沖液（1 mol/L）25 mL、膽固醇溶液1 mL，混合均勻[22]。在普通NGM（nematode growth medium）培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃后分別加入對應(yīng)濃度乙醇溶液。

1.3.2 E. coli OP50的培養(yǎng)與涂布

將37 ℃振蕩培養(yǎng)的E. coli OP50菌群涂布在NGM培養(yǎng)基上，涂好菌的平板封口倒置放在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，放入4 ℃冰箱中保存，以備喂養(yǎng)線蟲使用。

1.3.3 線蟲的同期化培養(yǎng)

將線蟲母液與同期化試劑（5 g/100mL NaClO溶液與5 mol/L NaOH溶液體積比為2∶1）以體積比7∶3的比例混勻，不斷振蕩混勻，直至線蟲解體溶液由渾濁變?yōu)槌吻澹ㄍ诨瘯r間控制在8～10 min），4 000 r/min離心50 s，棄上清液收集EP管底部沒有被同期化試劑破壞的蟲卵，將收集到的蟲卵用dH2O清洗3 次，接種于涂布有E. coli OP50的NGM平板上，置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育[23]。

1.3.4 線蟲壽命統(tǒng)計(jì)

從同期化3 d后的平板中選出大小一致且活躍度高的線蟲，各挑取35 只線蟲至添加有4（0.024%，體積分?jǐn)?shù)，下同）、40（0.240%）、400 mmol/L（2.400%）乙醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)，每24 h更換一次培養(yǎng)基，直至培養(yǎng)基中的線蟲全部死亡，統(tǒng)計(jì)線蟲壽命，并與對照組平板中線蟲進(jìn)行對比（數(shù)據(jù)剔除由于意外在培養(yǎng)皿壁上干死的線蟲）。將每天線蟲的死亡及存活數(shù)轉(zhuǎn)換成線蟲壽命，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析；同時，根據(jù)線蟲存活天數(shù)排序按式（1）計(jì)算平均壽命（mean of lifespan，MLS），平均壽命標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard error，SE）按式（2）計(jì)算。

式中：j為線蟲日齡；xj為該日齡線蟲存活條數(shù)；dj為（xj+xj+1）期間死亡的線蟲條數(shù)；n為線蟲的總條數(shù)。

1.3.5 線蟲壽命相關(guān)基因的表達(dá)

由于線蟲生命周期較短，選取8 d成熟期線蟲作為對照模板（對照組）；因其于第15天左右開始出現(xiàn)死亡個體，故選取第12天線蟲作為衰老模板。在第8、12天分別從對照組及具有顯著延壽作用的400 mmol/L乙醇實(shí)驗(yàn)組中各挑取線蟲20 只，使用Trizol進(jìn)行裂解，根據(jù)乙醇提取法提取RNA，并使用對應(yīng)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，最終獲取cDNA樣本。使用實(shí)時熒光定量PCR儀檢測其壽命相關(guān)基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)所用所有引物均為2 μmol/L且每對引物均以濃度1∶1混合（表2）。調(diào)整各個基因引物對添加量使得各基因最終擴(kuò)增效率均在1左右，最終確定12 μL實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系如表3所示，循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性20 s，61 ℃退火32 s，72 ℃延伸40 s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40；72 ℃完全延伸2 min。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物對信息Table 2 qPCR primers used in this study

表3 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)Table 3 qPCR reaction systems

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇對線蟲壽命的影響

不同濃度乙醇對線蟲壽命的影響情況如圖1、表4所示。從生存函數(shù)可以看出400 mmol/L乙醇可有效提高線蟲整個生命周期內(nèi)生存率，攝食4 mmol/L和40 mmol/L乙醇線蟲與對照組線蟲相比不存在顯著性差異。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較發(fā)現(xiàn)，400 mmol/L乙醇實(shí)驗(yàn)組線蟲壽命中位數(shù)和平均壽命分別提高了11.76%和15.78%，與其他3 組相比均存在顯著性差異（P＜0.05）。由此可見400 mmol/L乙醇具有延壽作用。

圖1 不同濃度乙醇對線蟲生存函數(shù)的影響Fig. 1 Survival function of C. elegans fed with different concentrations of ethanol

表4 不同濃度乙醇對線蟲壽命的影響Table 4 Lifespan of C. elegans fed with different concentrations of ethanol

2.2 不同濃度乙醇對壽命相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

圖2 線蟲壽命相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig. 2 Lifespan-related gene expression in C. elegans as detected by qPCR analysis

檢測線蟲成蟲后第8、12天4 個基因相對表達(dá)情況，結(jié)果由圖2可知，隨著線蟲衰老程度的增加，上述4 個基因表達(dá)量均顯著性下降（P＜0.05，P＜0.01）。喂食400 mmol/L乙醇于線蟲衰老階段均顯著抑制壽命相關(guān)基因的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），進(jìn)而有效延緩衰老進(jìn)程而顯著提高線蟲壽命。

3 結(jié) 論

高劑量飲用酒精類飲品所帶來的負(fù)面作用一直被人們深惡痛絕，但醫(yī)學(xué)上已經(jīng)證明，適量飲酒可以對人體產(chǎn)生真正的健康功效，比如降低膽固醇、強(qiáng)化智能、提高心血管機(jī)能等。本研究表明，少量、適度地補(bǔ)充乙醇亦存在潛在的增壽作用。通過喂食線蟲4、40、400 mmol/L乙醇溶液，觀察不同濃度乙醇對壽命長短的影響（乙醇劑量的選擇是通過對國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)以及本研究室的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較總結(jié)而定[9]）。結(jié)果表明，攝食400 mmol/L乙醇溶液具有延壽作用，喂食乙醇的實(shí)驗(yàn)組線蟲無論是壽命中位數(shù)還是平均壽命均發(fā)生顯著性提高（P＜0.05）。

衰老調(diào)控機(jī)理研究中，IIS傳導(dǎo)通路調(diào)控壽命的機(jī)理不僅已闡述得較為清楚，并且從酵母到小鼠都具有較高的保守性，因而成為當(dāng)代衰老研究中的核心通路[24]。該通路中daf-2可與細(xì)胞外的胰島素配體相結(jié)合而促使PI3K激活age-1的表達(dá)，進(jìn)而通過一系列信號傳導(dǎo)激活下游AKT/PKB同源物[25-27]。AKT-1，AKT-2和SGK-1組成的蛋白復(fù)合物受到因PDK-1磷酸化作用而被激活，并抑制IIS傳導(dǎo)通路若干下游基因（如daf-16）活性，繼而直接影響線蟲壽命[28]；而IIS傳導(dǎo)通路下游基因還可以調(diào)控mTOR傳導(dǎo)通路上游基因所形成的蛋白聚合體的生物學(xué)狀態(tài)，繼而影響壽命[29-30]。IIS傳導(dǎo)通路下游基因（如TSC1[31]和daf-16[28]）和mTOR傳導(dǎo)通路上游基因（如RHEB[32]和AKT1S1[33]）的表達(dá)情況如何受乙醇攝入的影響將在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上詳細(xì)研究并另行報(bào)道。

通過實(shí)驗(yàn)檢測第8、12天線蟲體內(nèi)age-1、pdk-1、akt-1和let-363的基因表達(dá)情況可知，上述基因隨著衰老進(jìn)程均呈現(xiàn)表達(dá)量上升趨勢，但喂食400 mmol/L乙醇可顯著抑制上述基因的表達(dá)。可以推斷，一定劑量乙醇的攝入有效抑制age-1和let-363基因的表達(dá)，在IIS傳導(dǎo)通路中age-1基因的下游基因pdk-1表達(dá)量下降，akt-1基因表達(dá)因受到pdk-1的調(diào)控作用表達(dá)同樣受到抑制。與此同時，mTOR傳導(dǎo)通路中l(wèi)et-363基因也因乙醇的攝入以及IIS傳導(dǎo)通路下游基因的抑制作用而表達(dá)下降，進(jìn)而調(diào)控一系列與衰老調(diào)控相關(guān)的基因?qū)е聣勖难娱L。由此可見，乙醇的增壽作用是通過調(diào)控IIS和mTOR兩個傳導(dǎo)通路共同實(shí)現(xiàn)的（圖3）。

圖3 乙醇對秀麗隱桿線蟲延壽作用的分子機(jī)制Fig. 3 Molecular mechanism for the effect of ethanol on lifespan extension in C. elegans

所以通過調(diào)節(jié)飲食來調(diào)節(jié)某一生物個體的壽命長短在理論上是可行的，但是任何一種生物的壽命調(diào)控的具體分子機(jī)制是非常復(fù)雜的，在本研究的基礎(chǔ)上，乙醇攝入如何帶來IIS傳導(dǎo)通路若干下游基因和mTOR傳導(dǎo)通路若干上游基因的表達(dá)變化，以及這些基因表達(dá)變化如何在更深入的分子水平上影響線蟲的壽命，值得我們進(jìn)一步研究。

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Effect of Ethanol on Caenorhabditis elegans Lifespan and Its Potential Molecular Mechanisms

WANG Jin, WANG Hongyuan, JIN Lingling, GUO Changlu, ZHANG Zhizhou*
(School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology (Weihai), Weihai 264200, China)

In this paper, the effect of ethanol on Caenorhabditis elegans lifespan was investigated by culturing it in a medium with different concentrations (4, 40 and 400 mmol/L) of ethanol. The results showed that 400 mmol/L ethanol could significantly extend the median lifespan by 11.76% and the mean lifespan by 15.78% (P 〈 0.05). The expression of lifespan-related genes (age-1, pdk-1, akt-1 and let-363) was detected using real-time quantitative polymerase chain reaction(qPCR) to explore the potential molecular mechanisms. Our results demonstrated that ethanol induced lifespan extension in C. elegans could be due to the suppressed expression of the above four genes and consequent regulation of the downstream genes in both the insulin/IGF signalling (IIS) and mammalian target of rapamycin (mTOR) pathways.

Caenorhabditis elegans; longevity; ethanol; signaling pathways

10.7506/spkx1002-6630-201721026

TS201.4

A

1002-6630（2017）21-0165-05

王晉, 王虹元, 金玲玲, 等. 乙醇對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及其分子機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 165-169.

10.7506/spkx1002-6630-201721026. http://www.spkx.net.cn

WANG Jin, WANG Hongyuan, JIN Lingling, et al. Effect of ethanol on Caenorhabditis elegans lifespan and its potential molecular mechanisms[J]. Food Science, 2017, 38(21): 165-169. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721026. http://www.spkx.net.cn

2016-07-14

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071170）；BIOX研究室啟動資金項(xiàng)目（HIT0904）

王晉（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：490764656@qq.com

*通信作者：張治洲（1967—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)、生物信息學(xué)。E-mail：15066317512@163.com