夏 陳，陳 建*，張盈嬌，朱永清，李華佳，鄧俊琳

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

紅陽(yáng)獼猴桃多糖組分的分離純化、單糖組成及其抑制癌細(xì)胞活性

夏 陳，陳 建*，張盈嬌，朱永清，李華佳，鄧俊琳

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

研究紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)多糖組分的分離純化、單糖組成及其對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用。用水提取總多糖，層析法分離純化多糖組分；高效凝膠滲透色譜測(cè)定組分的純度和分子質(zhì)量；高效液相色譜法測(cè)定多糖純組分的單糖組成；傅里葉變換紅外（Fourier transform-infrared，F(xiàn)T-IR）光譜鑒定多糖純組分的特征官能團(tuán)；用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法測(cè)定多糖純組分對(duì)肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌這5 種癌細(xì)胞的體外抑制活性。總多糖分離出ACP-1、ACP-2、ACP-3、ACP-4這4 種單組分多糖；其中ACP-3純度最高，分子質(zhì)量為2 663 kD，主要含有L-鼠李糖（17.78%，物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)，后同）、D-半乳糖醛酸（25.25%）、D-半乳糖（25.45%）、L-阿拉伯糖（20.51%）、D-葡萄糖（6.14%）、D-甘露糖（2.13%）、D-木糖（1.03%）、D-葡萄糖醛酸（0.97%）及少量D-巖藻糖（0.74%）；其FT-IR光譜圖有多糖特征官能團(tuán)的吸收峰。ACP-3對(duì)5 種癌細(xì)胞增殖的半數(shù)最大抑制濃度依次為0.646、0.310、0.642、0.281、0.575 μmol/L，對(duì)癌細(xì)胞增殖有抑制活性。

紅陽(yáng)獼猴桃果；多糖組分；提取分離；單糖組成；抑癌活性

紅陽(yáng)獼猴桃（Actinidia chinensis）屬中華系獼猴桃品種，是1989年從四川省蒼溪縣的中華獼猴桃實(shí)生苗中選出的大果紅肉新品種，富含多種維生素、氨基酸、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分且總糖含量高，其口感及品質(zhì)佳且售價(jià)高，被列入國(guó)家保護(hù)資源，并形成一種世界性產(chǎn)業(yè)[1-5]。目前已有關(guān)于紅陽(yáng)獼猴桃種植及果實(shí)貯藏保鮮的研究[6-8]，也有關(guān)于紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)中活性物質(zhì)總黃酮[9]、氨基酸[10]、花青素及多酚類等的研究[11-14]。獼猴桃果實(shí)多糖具有抗癌[15-16]、降血糖降血脂[17]、刺激皮膚膠原蛋白合成[18]、抗衰老[19]等生物活性。通常經(jīng)提取純化的總多糖中包括各種組分，其中僅部分組分是活性多糖，因此有必要把總多糖分級(jí)純化并做活性篩選得到活性多糖。目前鮮見對(duì)紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)多糖的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)總多糖的提取，通過二乙氨基乙基纖維素52（diethylaminoethyl cellulose 52，DEAE-52）和葡聚糖凝膠G200層析分離純化多糖組分，高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測(cè)定多糖組分的純度和分子質(zhì)量，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[20]測(cè)定多糖純組分的單糖組成，傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）光譜測(cè)定特征官能團(tuán)吸收峰，以及用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法[21]測(cè)定純組分的抑制癌細(xì)胞活性，為紅陽(yáng)獼猴桃營(yíng)養(yǎng)健康價(jià)值的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅陽(yáng)獼猴桃果產(chǎn)于成都市都江堰。

胃癌細(xì)胞SGC7901、結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肺癌細(xì)胞NCI-H460、肝癌細(xì)胞HepG2南京科佰公司；胎牛血清、胰蛋白酶 美國(guó)HyClone公司。

DEAE-52、葡聚糖凝膠G200、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-巖藻糖對(duì)照品、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；透析袋（截留分子質(zhì)量大于3 000 D） 華美生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750分光光度計(jì) 日本島津公司；Hei-VAP Advantage ML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京比朗有限公司；H2050R-1高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；1260型HPLC儀 美國(guó)安捷倫公司；MILLI-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；IGO150二氧化碳培養(yǎng)箱、ST-360酶標(biāo)儀上?？迫A生物工程股份有限公司；EclipseTS100倒置式生物顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 紅陽(yáng)獼猴桃總多糖的提取

稱取2.0 kg成熟的紅陽(yáng)獼猴桃果，打漿，加入6 000 mL蒸餾水，于40 ℃攪拌提取2 h；然后6 000 r/min離心8 min，后續(xù)離心條件相同，取上清液， 60 ℃減壓濃縮至3 00 mL溶液，加入9 mL 2 mol/L三氯乙酸溶液沉降蛋白質(zhì)；然后離心除蛋白質(zhì)，取上清液加入2 倍體積無水乙醇，醇沉12 h；離心，取沉淀復(fù)溶于水，再加入2 倍體積無水乙醇，醇沉12 h；再離心，取沉降物經(jīng)冷凍干燥得略帶色固體，稱質(zhì)量。將所得固體物取樣配制成1 mg/mL水溶液，分別于280 nm和260 nm波長(zhǎng)處做紫外掃描，檢測(cè)其蛋白質(zhì)和核酸含量情況；用碘-碘化鉀試劑檢測(cè)其是否含有淀粉；咔唑-硫酸試劑檢測(cè)是否含有糖醛酸。用苯酚-硫酸法[22]檢測(cè)該固體的總多糖含量。根據(jù)公式（1）計(jì)算總多糖得率。

式中：m1為總多糖質(zhì)量/g；m2為鮮果質(zhì)量/g。

1.3.2 紅陽(yáng)獼猴桃總多糖的分離純化

1.3.2.1 DEAE-52離子交換層析

將紅陽(yáng)獼猴桃粗多糖配制成質(zhì)量濃度3.8 mg/mL的溶液，用蒸餾水平衡DEAE-52（中等堿性陰離子交換劑）層析柱后，上樣10 mL溶液，控制洗脫流速為0.8 mL/min，先用60 mL超純水洗脫，再依次以0.1、0.2、0.3、1.0 mol/L的NaCl溶液各100 mL洗脫，每10 mL收集一管，并用苯酚-硫酸法[22]測(cè)定多糖含量，繪制曲線圖，合并同一洗脫峰的收集液，濃縮、透析、凍干。多次上樣分離粗多糖，用前述層析條件制備各單組分多糖樣品。以苯酚-硫酸法測(cè)定各單組分多糖含量。根據(jù)公式（2）計(jì)算各單組分多糖的得率。

式中：m1為各單組分多糖質(zhì)量/g；m2為總多糖質(zhì)量/g。

1.3.2.2 葡聚糖凝膠G200二次分離純化

取DEAE-52離子交換層析分離純化得到的單組分多糖各20 mg，分別配制成質(zhì)量濃度5.0 mg/mL的溶液樣品，用蒸餾水平衡葡聚糖凝膠G200層析柱，上樣1 mL，用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，控制洗脫流速為0.8 mL/min，每3 mL收集于一管并測(cè)定單組分多糖含量，繪制曲線圖，并收集單一峰洗脫液。

1.3.3 單組分多糖純度及分子質(zhì)量測(cè)定

采用HPGPC法，精確稱量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g，其分子質(zhì)量分別為6、10、40、100、200、500、2 000、5 000 kD，用純凈水溶解并定容至100 mL，配制成5 mg/mL的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。色譜柱為PL aquagel-OH不銹鋼柱（300 mm×7.5 mm，8 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為純凈水；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，柱溫40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。用標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值（lg M）對(duì)洗脫時(shí)間做洗脫曲線，得到葡聚糖分子質(zhì)量分布的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同樣操作方法和色譜條件測(cè)定獼猴桃果單組分多糖的洗脫曲線，測(cè)定其純度，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到單組分多糖的分子質(zhì)量。

1.3.4 單組分多糖的組成分析

1.3.4.1 單組分多糖的水解

取紅陽(yáng)獼猴桃單組分多糖約20 mg，加入到5.0 mL的安瓿瓶中，向瓶中加入4.0 mL 2 mol/L H2SO4溶液，用酒精噴燈封管，然后將瓶置于烘箱中于l05 ℃水解8 h。冷卻后取反應(yīng)瓶，用BaCO3調(diào)整H2SO4溶液至pH 7，然后于6 000 r/min離心6 min，取上清液；沉淀再用5 mL蒸餾水超聲洗滌，6 000 r/min離心，取上清液；將2 次的上清液合并，用0.25 μm微孔濾膜過濾后，于80 ℃濃縮至0.5 mL備用。

1.3.4.2 PMP柱前衍生-HPLC法分析單糖組成

單糖衍生：分別取1.3.4.1節(jié)的水解濃縮液和D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-巖藻糖9 種單糖對(duì)照品溶液（3.0 mmol/L）各400 μL，依次加入200 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和400 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混勻；于70 ℃水浴反應(yīng)40 min，取出，冷卻10 min后，用400 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和；然后以2 mL氯仿萃?。ㄤ鰷u振蕩，6 000 r/min離心8 min），細(xì)針頭吸棄下層氯仿相，重復(fù)萃取3 次。取上層水相，過濾，以10 μL進(jìn)樣。

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為室溫；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相分別為：（A）0.05 mol/L磷酸鹽溶液（pH 6.9）-15%乙腈、（B）0.05 mol/L磷酸鹽溶液（pH 6.9）-40%乙腈，線性洗脫為0～10 min，0%～8% B，10～30 min，8%～20% B。

采用面積歸一化法按公式（3）計(jì)算各單糖組分的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)。

式中：S1為各單糖組分峰面積/（mAU·s）；S2為各單糖組分峰面積之和/（mAU·s）。

1.3.5 單組分多糖的FT-IR光譜檢測(cè)

取5.0 mg單組分多糖組分樣品，用溴化鉀（KBr）壓片法，以FT-IR光譜儀于4 000～600 cm-1掃描測(cè)試。

1.3.6 單組分多糖的癌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 癌細(xì)胞培養(yǎng)

分別取胃癌細(xì)胞SGC7901、結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肺癌細(xì)胞NCI-H460、肝癌細(xì)胞HepG25 種癌細(xì)胞株，吸出舊培養(yǎng)液，再加入500 μL的新鮮胰酶，消化3～4 min。用顯微鏡觀察至細(xì)胞被完全消化，脫壁后，加入3 mL培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打混勻。將液體轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，于8 000 r/min離心4 min。取出離心管，吸出管內(nèi)液體，加入新培養(yǎng)液1 mL，用無菌槍頭反復(fù)吹打使細(xì)胞充分混勻，然后將細(xì)胞放于37 ℃及含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6.2 對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT法進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)期的這5 種癌細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液至密度約為5×104個(gè)/mL，每孔100 μL加入到96 孔板，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察并加入紅陽(yáng)獼猴桃單組分多糖樣品溶液。樣品溶液加入結(jié)束后，每孔加入100 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，求抑制率和半數(shù)最大抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅陽(yáng)獼猴桃總多糖的提取

得到略帶色固體狀產(chǎn)物10.5 g，相對(duì)于鮮果質(zhì)量得率為0.525%。該固體物溶液經(jīng)紫外掃描，在280 nm和260 nm波長(zhǎng)處吸收信號(hào)極低，表明其幾乎不含蛋白質(zhì)和核酸。碘-碘化鉀試劑檢測(cè)結(jié)果顯示不含淀粉。咔唑-硫酸試劑檢測(cè)結(jié)果表明含有糖醛酸。該固體物經(jīng)苯酚-硫酸法定性鑒定為多糖，定量計(jì)算得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73%。通常不同的提取方法對(duì)多糖的純度、理化性質(zhì)及生物活性會(huì)產(chǎn)生影響。文獻(xiàn)報(bào)道過不同提取方法對(duì)軟棗獼猴桃果多糖單糖組成及抗氧化活性的影響，有高溫、低溫、微波助提3 種方法[23]，其中采用100 ℃高溫水提多糖溶入了大量淀粉，而采用與本實(shí)驗(yàn)相同的低溫（40 ℃）水提方法則不含淀粉。本實(shí)驗(yàn)采用低溫水提法有利于保持總多糖的天然性狀及純度，也避免了高溫或微波助提方法導(dǎo)致多糖分子斷裂和理化性質(zhì)的改變。

2.2 總多糖的分離純化及單組分多糖分子質(zhì)量

2.2.1 DEAE-52離子交換層析分析

圖1 總多糖的DEAE-52離子交換層析Fig. 1 Chromatography of crude polysaccharides on DEAE-52 column

由圖1可知，紅陽(yáng)獼猴桃總多糖經(jīng)DEAE-52柱層析梯度洗脫分離后得到4 個(gè)洗脫峰：ACP-1、ACP-2、ACP-3和ACP-4。其中60～120 mL洗脫液為0.1 mol/L NaCl，洗脫得到第一個(gè)組分ACP-1；140～220 mL洗脫液為0.1、0.2 mol/L NaCl，洗脫得到組分ACP-2；230～290 mL洗脫液為0.2、0.3 mol/L NaCl，洗脫得到組分ACP-3；300～370 mL洗脫液為0.3 mol/L NaCl，洗脫得到組分ACP-4。色譜柱多次上樣分離，合并同一洗脫峰的收集液經(jīng)處理后得到紅陽(yáng)獼猴桃4 個(gè)組分多糖固體：ACP-1 250.2 mg，相對(duì)總多糖固體的得率（后同）為11.56%，多糖含量（后同）為82.5%；ACP-2 854.3 mg，得率39.50%，多糖含量83.7%；ACP-3 588.1 mg，得率27.20%，多糖含量84.3%；ACP-4 308.6 mg，得率14.25%，多糖含量87.2%；4 個(gè)組分的總得率為92.51%。為了確認(rèn)這4 個(gè)組分為單組分多糖，以利于對(duì)其進(jìn)行深入的理化和活性特性研究，又對(duì)這4 個(gè)組分分別用葡聚糖凝膠G200進(jìn)行第二次分離實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 單組分多糖的葡聚糖凝膠G200二次分離

ACP-1、ACP-2、ACP-3、ACP-4經(jīng)葡聚糖凝膠G200柱層析，結(jié)果如圖2所示。ACP-1經(jīng)二次層析分離得4 個(gè)洗脫峰，表明該組分含有4 種分子質(zhì)量范圍的多糖。由于在葡聚糖凝膠G200層析柱中，這4 個(gè)洗脫峰分離度低，不易收集，因此本研究不再對(duì)該組分進(jìn)一步探討。而單組分多糖ACP-2、ACP-3、ACP-4經(jīng)過葡聚糖凝膠G200柱層析時(shí)仍然得到單一洗脫峰，表明這3 種組分為均勻多糖組分，并以HPGPC測(cè)定其純度并計(jì)算分子質(zhì)量。

圖2 4 種單組分多糖的葡聚糖凝膠G200層析Fig. 2 Chromatography of four polysaccharide fractions on Sephadex G200 column

2.2.3 單組分多糖的純度和分子質(zhì)量

圖3 ACP-2（A）、ACP-3（B）和ACP-4（C）的HPGCP圖Fig. 3 HPGCP chromatograms of ACP-2 (A), ACP-3 (B) and ACP-4 (C)

HPGCP測(cè)定結(jié)果如圖3所示，ACP-2和ACP-4仍非純組分，DEAE-52離子交換層析和葡聚糖凝膠G200層析對(duì)單組分多糖的分離效率都不如HPGCP。HPGCP結(jié)果證明ACP-3是純度最高的一個(gè)單組分多糖，在6.744 min有峰型很好的主峰，僅在7.228 min有一小的洗脫峰。根據(jù)制備的葡聚糖分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得ACP-3的分子質(zhì)量為2 663 kD。鑒于ACP-3的純度最高，故采用ACP-3進(jìn)一步研究其單糖組成和FT-IR光譜特征，及其抑制癌細(xì)胞增殖的生物活性。

2.3 ACP-3的單糖組成及結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 PMP柱前衍生-HPLC法分析單糖組成

圖4 ACP-3單糖組成的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of monosaccharides from ACP-3

由圖4可知，ACP-3含有全部對(duì)照的9 種單糖；各種單糖的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)分別為：L-鼠李糖17.78%、D-半乳糖醛酸25.25%、D-半乳糖25.45%、L-阿拉伯糖20.51%、D-葡萄糖6.14%、D-甘露糖2.13%、D-木糖1.03%、D-葡萄糖醛酸0.97%、及少量D-巖藻糖0.74%；另外可能還有少量未被標(biāo)識(shí)的單糖。與文獻(xiàn)報(bào)道的軟棗獼猴桃果多糖單糖組成[23]相比，同是低溫水提取方法，紅陽(yáng)獼猴桃單組分多糖ACP-3的D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖含量遠(yuǎn)高于軟棗獼猴桃對(duì)應(yīng)單糖含量（6.64%、4.16%）；而其含有的D-甘露糖和L-阿拉伯糖則遠(yuǎn)低于軟棗獼猴桃多糖的這2種單糖（14.35%、38.37%）；紅陽(yáng)獼猴桃ACP-3的D-半乳糖含量與軟棗獼猴桃的D-半乳糖含量（24.75%）接近。結(jié)果也說明紅陽(yáng)獼猴桃果多糖與其他獼猴桃品種的多糖存在差異，有其自身特點(diǎn)。

2.3.2 FT-IR光譜分析

圖5 多糖組分ACP-3的FT-IR光譜圖Fig. 5 FT-IR spectrum of ACP-3

紅陽(yáng)獼猴桃ACP-3的FT-IR光譜分析由圖5可知，ACP-3具有多糖的結(jié)構(gòu)特征吸收[24-26]：在波數(shù)3 426 cm-1左右處出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰是羥基的O—H伸縮振動(dòng)吸收峰；在波數(shù)2 940 cm-1處左右出現(xiàn)的弱的吸收峰是烷基的C—H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 614 cm-1和1 416 cm-1處的吸收峰正是含有的糖醛酸羰基（C＝O）伸縮振動(dòng)峰，且糖醛酸可能以鈉鹽的形式存在，該紅外吸收特征峰印證了糖醛酸單糖成分的存在；1 200～1 000 cm-1是C—O—C和C—O—H伸縮振動(dòng)。

2.4 ACP-3對(duì)癌細(xì)胞毒性的影響

圖6 ACP-3對(duì)5 種癌細(xì)胞抑制率的影響Fig. 6 Inhibitory effect of ACP-3 on the proliferation of five cancer cells

ACP-3含有多種成分的單糖，推測(cè)其生物活性可能具有多樣性，用MTT法體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定其對(duì)5 種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率及其IC50，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)ACP-3濃度小于等于0.375 5 μmol/L時(shí)，其對(duì)5 種癌細(xì)胞的抑制率均隨ACP-C濃度的增大而顯著增加（P＜0.05）；但超過0.375 5 μmol/L后，對(duì)不同癌細(xì)胞的抑制率有所不同，對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H460的抑制率呈顯著性增加（P＜0.05），對(duì)其余癌細(xì)胞的抑制率均未因濃度增大而產(chǎn)生顯著性差異；當(dāng)ACP-3濃度從1.502 1 μmol/L上升至3.004 2 μmol/L時(shí)，對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H460和乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的抑制率無顯著增加，但對(duì)其余癌細(xì)胞的抑制率均有顯著性增加（P＜0.05）。ACP-3對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H460、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肝癌細(xì)胞HepG2、胃癌細(xì)胞SGC7901、結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的IC50，由計(jì)算得到分別為0.646、0.310、0.642、0.281、0.575 μmol/L。ACP-3對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的IC50最小，因而對(duì)其抑制活性最大；其次是對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用；對(duì)其他3 種癌細(xì)胞的作用相對(duì)較弱。多糖的抗癌作用包括間接（免疫刺激）和直接（抑制細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡）兩種途徑[27-30]。ACP-3對(duì)胃癌和乳腺癌細(xì)胞的抑制活性相對(duì)強(qiáng)，值得探討其對(duì)癌細(xì)胞的抑制機(jī)制，并可作為合適的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾以期顯著提高其抑癌活性。

3 結(jié) 論

紅陽(yáng)獼猴桃果經(jīng)提取的總多糖分離得ACP-1、ACP-2、ACP-3、ACP-4 4 種單組分多糖，其中純度最高的組分是ACP-3，其分子質(zhì)量為2 663 kD；其含有的單糖種類多樣，包括L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸及少量D-巖藻糖等；單糖組成的多樣性是多糖組分生物活性的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；ACP-3組分的FT-IR光譜分析也確認(rèn)有源于單糖結(jié)構(gòu)中的C＝O、O—H、C—H、C—O—C官能團(tuán)的特征吸收。ACP-3對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的肺癌細(xì)胞NCI-H460、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肝癌細(xì)胞HepG2、胃癌細(xì)胞SGC7901、結(jié)腸癌細(xì)胞HT29這5 種癌細(xì)胞增殖都有一定抑制活性，且對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制活性最大。研究結(jié)果提示了紅陽(yáng)獼猴桃果多糖的保健功能，也為紅陽(yáng)獼猴桃（特別是其殘次果）的精深加工及增值利用提供了理論依據(jù)。

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Isolation, Purification, Monosaccharide Composition and Anticancer Proliferation Activity of Polysaccharide Fraction from Hongyang Kiwi Fruits (Actinidia chinensis)

XIA Chen, CHEN Jian*, ZHANG Yingjiao, ZHU Yongqing, LI Huajia, DENG Junlin

(Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

The aim of this study was the isolation, purification, monosaccharide composition and anticancer activity of polysaccharide fractions from Hongyang kiwi fruits. Crude polysaccharides were obtained through water extraction.Column chromatography was applied to isolate and purify polysaccharide fractions. High performance gel permeation chromatography (HPGPC) was carried out to test the purity and molecular masses of the fractions. Monosaccharide composition of the purest polysaccharide fraction was tested by high performance liquid chromatography (HPLC), and its characteristic functional groups were identified by Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy. The in vitro growth inhibitory effect of the pure polysaccharide fraction on lung cancer cell NCI-H460, breast cancer cell MCF-7, liver cancer cell HepG2, gastric cancer cell SGC7901, and colorectal cancer cell HT29 were determined by the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay. Four fractions (ACP-1, ACP-2, ACP-3 and ACP-4)were isolated from the crude polysaccharides. ACP-3 was the purest fraction with a molecular mass of 2 663 kD. The monosaccharide composition analysis indicated that ACP-3 consisted of L-rhamnose (17.78%), D-galacturonic acid (25.25%),D-galactose (25.45%), L-arabinose (20.51%), D-glucose (6.14%), D-mannose (2.13%), D-xylose (1.03%), D-glucuronic acid(0.97%) and D-fucose (0.74%). The characteristic absorbance of functional groups was observed in the FT-IR spectrum of ACP-3 fraction. The half maximal inhibitory concentrations (IC50) of ACP-3 against NCI-H460, MCF-7, HepG2, SGC7901 and HT29 cell lines were 0.646, 0.310, 0.642, 0.281 and 0.575 μmol/L, respectively. ACP-3 showed a significant inhibitory effect on the proliferation of all tested cancer cell lines.

Hongyang kiwi fruit; polysaccharide fraction; extraction and isolation; monosaccharide composition; anticancer activity

10.7506/spkx1002-6630-201721020

TS255.1

A

1002-6630（2017）21-0126-06

2016-07-19

四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程優(yōu)秀論文基金專項(xiàng)（2014LWJJ-008）；四川省農(nóng)科院條件建設(shè)專項(xiàng)-院人才項(xiàng)目

夏陳（1983—），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)楣δ苁常ㄋ帲┢贰-mail：xiachen3722496@163.com

*通信作者：陳建（1969—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)楣δ苁常ㄋ帲┢?。E-mail：jc_saas@yahoo.com

夏陳, 陳建, 張盈嬌, 等. 紅陽(yáng)獼猴桃多糖組分的分離純化、單糖組成及其抑制癌細(xì)胞活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21):126-131.

10.7506/spkx1002-6630-201721020. http://www.spkx.net.cn

XIA Chen, CHEN Jian, ZHANG Yingjiao, et al. Isolation, purification, monosaccharide composition and anticancer proliferation activity of polysaccharide fraction from Hongyang kiwi fruits (Actinidia chinensis)[J]. Food Science, 2017,38(21): 126-131. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721020. http://www.spkx.net.cn