韓苗苗，姚 娟，易 陽,*，黃 菲，王麗梅

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

龍眼果肉干燥過程中多糖的理化特征與活性變化規(guī)律

韓苗苗1，姚 娟1，易 陽1,*，黃 菲2，王麗梅3

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

探析龍眼果肉熱風(fēng)干燥過程中多糖的理化特性和生物活性變化規(guī)律。分離不同干燥階段果肉中的多糖，通過對基本組成、傅里葉變換紅外光譜圖特征和相對分子質(zhì)量分布的分析，比較其理化特征差異，結(jié)合體外抗氧化、抗腫瘤和免疫刺激效果評價比較其生物活性。隨著干燥的進(jìn)行，多糖中中性糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比、葡萄糖和甘露糖物質(zhì)的量比、游離氨基含量均呈逐漸降低的趨勢，傅里葉變換紅外光譜圖的酰胺區(qū)特征吸收峰明顯改變，高效分子排阻色譜的新高分子組分在干燥后期生成。而體外抗氧化活性評價發(fā)現(xiàn)，果肉干燥12～60 h，其多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力、對羥自由基清除能力、總抗氧化能力得到明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；干燥12～24 h，對SGC7901和HepG2腫瘤細(xì)胞的生長抑制能力、刺激巨噬細(xì)胞一氧化氮和腫瘤壞死因子α生成的綜合能力得到明顯增強(qiáng)（P＜0.05），但干燥60 h后有所減弱。不同干燥階段多糖的生物活性差異可能與美拉德反應(yīng)關(guān)聯(lián)的多糖-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，結(jié)果可為龍眼干肉的高品質(zhì)加工提供參考。

龍眼果肉；多糖；理化特性；生物活性；美拉德反應(yīng)

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）屬于藥食兩用水果，營養(yǎng)及風(fēng)味俱佳，而且具有補(bǔ)益心脾和養(yǎng)血安神的功能[1]。龍眼鮮果上市時間較為集中，貯運(yùn)過程中代謝旺盛，極易褐變腐爛，產(chǎn)業(yè)發(fā)展高度依賴干制加工，僅肉干加工量已占其總產(chǎn)量的15.50%[2]。故而，龍眼果肉干制加工技術(shù)研究，尤其是產(chǎn)品的品質(zhì)影響與調(diào)控引起廣泛關(guān)注[3-7]。龍眼干制產(chǎn)品的品質(zhì)控制大體涉及2 個方面，其一為傳統(tǒng)的感官變化和營養(yǎng)成分損失[3-4,6]，其二為特異的主要活性成分變化[7-8]。而在“藥食同源”這一資源特色背景下，后者相關(guān)研究更具意義，但卻更為薄弱。

多糖是龍眼果肉中的主要活性大分子，具有良好的體內(nèi)外抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，其理化表征、活性評價與作用機(jī)制研究均取得一定進(jìn)展[9-12]。然而，龍眼果肉干制過程中的多糖變化規(guī)律研究尚鮮見報道。課題組前期比較龍眼鮮肉多糖（flesh longan pulp polysaccharide，LPF）和干肉多糖（dried longan pulp polysaccharide，LPD）的理化特征及免疫調(diào)節(jié)活性發(fā)現(xiàn)[13-14]：LPD中結(jié)合蛋白含量較高且結(jié)合作用力較強(qiáng)，采用450 W超聲處理15 min難以破壞；LPF的平均相對分子質(zhì)量較LPD低，其結(jié)合蛋白經(jīng)150 W超聲處理15 min便解離；在50～400 μg/mL劑量范圍內(nèi)，LPD的脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激活性明顯強(qiáng)于LPF，而兩者結(jié)合蛋白解離均伴隨刺激活性的減弱。由此說明，干制可能導(dǎo)致龍眼果肉中多糖組成與結(jié)構(gòu)的變化，并進(jìn)一步影響其生物活性。為此，本實(shí)驗(yàn)研究龍眼果肉熱風(fēng)干制過程中多糖的理化特征及活性變化規(guī)律，旨為龍眼干肉制品功能品質(zhì)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮龍眼 市售。

人胃癌細(xì)胞SGC7901、人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7 湖北百奧斯生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 美國Hyclone公司；胰酶 杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞活力檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 南京恩晶生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 武漢基因美科技有限公司；鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-賴氨酸 上海如吉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrythydrazyl，DPPH）、2,4,6-三吡啶基三嗪 東京化成工業(yè)株式會社；色譜純單糖標(biāo)準(zhǔn)品（D-甘露糖、D（+）-無水葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-（+）-木糖、D-核糖、D-葡萄糖醛酸和鼠李糖） 上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SUNRISE酶標(biāo)定量測定儀 西化儀（北京）科技有限公司；NEXUS-670 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國尼高力儀器公司；高效液相色譜系統(tǒng)（包括示差折光（differential refractive index，RI）檢測器2414、二極管矩陣（photodiode array，PDA）檢測器2998和二元泵1525），分子排阻色譜柱Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）美國Warters公司；Extend-C18色譜柱（4.6 nm×250 mm，5 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 LP的提取

[8]的方法，采用60 ℃熱風(fēng)干燥龍眼果實(shí)，干燥過程中間隔12 h或24 h取樣。取龍眼果肉約100 g（干質(zhì)量），加入1 L蒸餾水，12 000 r/min勻漿5 min。勻漿置于80 ℃的水浴鍋中攪拌浸提3 h后，4 500 r/min離心10 min后過濾分離上清液。上清液經(jīng)真空濃縮至原體積的1/4后加入3 倍體積無水乙醇，于4 ℃條件下靜置12 h，4 500 r/min離心10 min，去除上清液，沉淀即為多糖。沉淀以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗滌3 次，加少量蒸餾水復(fù)溶后冷凍干燥，得到LP。將龍眼果肉干燥0、12、24、36、60、84h后分離制備所得粗多糖，分別命名為LP-0、LP-12、LP-24、LP-36、LP-60、LP-84。

1.3.2 基本成分分析

中性多糖含量采用苯酚-硫酸法測定[15]，以葡萄糖當(dāng)量計算；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定；糖醛酸含量采用間羥基聯(lián)苯法測定[16]，以葡萄糖醛酸當(dāng)量計算。

游離氨基含量測定參照Nielsen等[17]的方法，采用OPA試劑測定：4 mL OPA試劑和200 μL多糖溶液（5 mg/mL）在35 ℃的水浴中反應(yīng)2 min后，立即測定340 nm波長處的吸光度。以系列濃度的L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算多糖中的游離氨基含量。

單糖組成參照莫開菊等[18]的方法測定，采用反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法。

1.3.3 FTIR分析

取1 mg多糖和100 mg干燥的KBr粉末置于瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片后在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍進(jìn)行FTIR檢測[19]。

1.3.4 相對分子質(zhì)量分布分析

采用高效分子排阻色譜（high perfomance size exclusion chromatography，HPSEC）檢測LP的相對分子質(zhì)量分布。色譜分析條件為：PDA檢測器（280 nm）和RI檢測器串聯(lián)使用；色譜柱Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm），柱溫45 ℃；流動相0.1 mol/L硝酸鈉；洗脫流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積15 μL。采用0.1 mol/L硝酸鈉配制2.5 mg/mL的LP樣液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。采用低相對分子質(zhì)量凝膠過濾校準(zhǔn)試劑盒測定不同相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的保留時間建立lg Mr-t曲線方程。

1.3.5 體外抗氧化活性評價

LP的DPPH自由基清除能力參照Wu Hao等[20]的方法測定，以對DPPH自由基清除率為50%時的樣品質(zhì)量濃度（半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）/（mg/mL））表征其清除能力。

LP的羥自由基清除能力參照Smirnoff等[21]的方法測定，以羥自由基清除率為25%時的樣品質(zhì)量濃度（IC25/（mg/mL））表征其清除能力。

LP的總抗氧化能力采用鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）表征[22]，以每克樣品還原Fe3+物質(zhì)的量表示。

1.3.6 體外抗腫瘤活性評價

采用CCK-8方法檢測LP的腫瘤細(xì)胞抑制率。取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞或HepG2細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基（含10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清）調(diào)整細(xì)胞密度為4×104個/mL，以100 μL/孔加入96 孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后，加入100 μL由培養(yǎng)基溶液配制的LP溶液，LP終質(zhì)量濃度為200、400、800 μg/mL，各質(zhì)量濃度均設(shè)5 個復(fù)孔作為實(shí)驗(yàn)組。以培養(yǎng)基代替樣品溶液作為對照組。另設(shè)5 個孔只加入200 μL培養(yǎng)基作為空白組。培養(yǎng)板孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)溫PBS洗滌2 次以除去未貼壁細(xì)胞。各孔加入200 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育3 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值。根據(jù)下式計算腫瘤細(xì)胞抑制率。

式中：OD實(shí)驗(yàn)組為實(shí)驗(yàn)組在450 nm波長處OD值；OD對照組為對照組在450 nm波長處的OD值；OD空白組為空白組在450 nm波長處的OD值。

1.3.7 體外巨噬細(xì)胞刺激活性評價

LP的體外免疫刺激活性結(jié)合巨噬細(xì)胞一氧化氮（nitric oxide，NO）生成量和TNF-α表達(dá)量評價。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)DMEM培養(yǎng)基（含10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清）調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，以400 μL/孔加入24 孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)3 h后，吸除培養(yǎng)液。每孔加入由培養(yǎng)基溶液配制的LP溶液400 μL，LP終質(zhì)量濃度為100、200、400 μg/mL，LPS終質(zhì)量濃度為5 μg/mL。每個質(zhì)量濃度設(shè)4 個復(fù)孔。另設(shè)4 個孔各加入400 μL培養(yǎng)基作為空白對照。培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱中孵育48 h后，吸取細(xì)胞上清液于1.5 mL離心管中，加入300 g/L的ZnSO4溶液沉淀蛋白，經(jīng)12 000 r/min離心4 min后，取100 μL上清液于96 孔培養(yǎng)板中，并加入100 μL的格里斯氏試劑，室溫條件下輕輕搖振10 min后，用酶標(biāo)儀在492 nm波長處測定OD值，每個實(shí)驗(yàn)孔重復(fù)測定3 次。以NaNO2建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計算巨噬細(xì)胞NO生成量。采用相同流程刺激培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48 h，取上清液于12 000 r/min離心4 min后，采用試劑盒測定TNF-α表達(dá)水平，每孔重復(fù)測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)在0.05水平上的顯著性差異采用S-N-K檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)相關(guān)性采用Pearson雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥階段LP的基本組成

不同干燥階段LP的基本組成如表1所示，LP中中性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨干燥時間的延長逐漸降低，但干燥60 h后，變化顯著（P＜0.05）；干燥12 h后，LP中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05），但隨干燥時間進(jìn)一步延長，未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）；干燥的前24 h，LP中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），但隨后顯著增加（P＜0.05）；LP中游離氨基含量在熱風(fēng)干燥24 h后顯著降低（P＜0.05），至84 h有所回升；折算LP中蛋白質(zhì)組分的游離氨基含量，發(fā)現(xiàn)其含量在干燥36 h明顯減少。

表1 不同干燥階段龍眼果肉中多糖的基本組成Table 1 Proximate composition of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

干熱和濕熱體系中的多糖-蛋白質(zhì)相互作用一直備受關(guān)注，該大分子間相互作用由蛋白質(zhì)游離氨基與多糖羰基的美拉德共價結(jié)合引發(fā)，并產(chǎn)生Amadori重排、分子裂解、脫水、Strecker降解、氧化、環(huán)化等一系列后續(xù)反應(yīng)[23]。而這一反應(yīng)亦有可能發(fā)生在龍眼果肉干燥過程中，因?yàn)長P中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，且蛋白質(zhì)中游離氨基含量逐漸減少，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的原因不明，而低聚木糖與甘氨酸的美拉德反應(yīng)亦發(fā)生糖醛酸含量的增加，同時伴隨還原糖含量的降低[24]。

圖1 不同干燥階段龍眼果肉中多糖的單糖組成RP-HPLC分析圖譜Fig. 1RP-HPLC chromatograms of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

10 種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的RP-HPLC色譜圖如圖1所示，出峰順序依次為D-甘露糖（10.073 min）、D-核糖（11.695 min）、鼠李糖（14.536 min）、D-葡萄糖醛酸（15.361 min）、D-半乳糖醛酸（16.414 min）、D-果糖（19.395 min）、D（+）-無水葡萄糖（24.549 min）、D-半乳糖（28.082 min）、木糖（29.665 min）、D-阿拉伯糖（29.895 min）。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對，確定LP主要由D-甘露糖和D（+）-無水葡萄糖組成。

由表2可知，不同干燥階段LP的單糖組成存在差異，特別地，D（+）-無水葡萄糖與D-甘露糖的物質(zhì)的量比值隨干燥時間的延長而逐漸降低，可能與多糖-蛋白質(zhì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的裂解和Strecker降解有關(guān)。

表2 不同干燥階段龍眼果肉中多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

2.2 不同干燥階段LP的FTIR分析

由圖2可知，不同干燥階段LP的FTIR均呈現(xiàn)多糖和蛋白質(zhì)的特征吸收。3 420 cm-1附近的吸收峰是由糖類分子間或分子內(nèi)的O—H鍵伸縮振動產(chǎn)生，2 924 cm-1附近的吸收峰為烷基的C—H鍵伸縮振動產(chǎn)生，這兩組峰均屬于多糖的特征吸收峰[25]。另有3 組蛋白質(zhì)的特征吸收譜帶，分別為1 700～1 600 cm-1酰胺Ⅰ區(qū)（C＝O伸縮振動）、1 480～1 575 cm-1酰胺Ⅱ區(qū)（N—H彎曲振動和C—N伸縮振動）和1 260～1 330 cm-1酰胺Ⅲ區(qū)（O—H彎曲振動）[26]。1 180～953 cm-1范圍內(nèi)的吸收譜帶被稱為“糖帶”，是由C—C和C—O的伸縮振動以及C—H的彎曲振動引起的，蛋白質(zhì)在此譜帶的吸收較弱[27]。隨著熱風(fēng)干燥時間的延長，LP在1 150 cm-1范圍的吸收減弱可能與多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合有關(guān)。

2.3 不同干燥階段LP的相對分子質(zhì)量分布

采用雙檢測器串聯(lián)的HPSEC檢測LP的相對分子質(zhì)量分布，其中示差折光信號反映以多糖為主的整體相對分子質(zhì)量分布情況（圖3A），280 nm紫外吸收信號反映含蛋白組分的相對分子質(zhì)量分布情況（圖3B）。不同干燥階段LP在保留時間18.18 min和18.52 min處出現(xiàn)兩個主要的HPSEC-RI色譜峰，對應(yīng)相對分子質(zhì)量分別為4.50×103和4.37×103。此外，LP-84和LP-60均在10.89 min和12.55 min出現(xiàn)2 個弱峰，對應(yīng)相對分子質(zhì)量分別為9.18×104和2.48×104。HPSEC-PDA色譜圖中，保留時間13.88 min附近的主要色譜峰應(yīng)屬游離蛋白質(zhì)，而LP-60和LP-84在10.26、12.74 min時的新生色譜峰應(yīng)屬于結(jié)合蛋白（與HPSEC-RI圖譜吻合）。由此可知，干燥60 h后，龍眼果肉中大分子組分發(fā)生相互作用，生成相對分子質(zhì)量更高的復(fù)合物。

圖3 不同干燥階段龍眼果肉中多糖的HPSEC圖譜Fig. 3 HPSEC chromatograms of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

綜合LP的基本組成、FTIR和相對分子質(zhì)量分布變化規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)干燥過程中的多糖和蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，且反應(yīng)主要在干燥36 h后發(fā)生。目前，多糖和蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)研究主要依托于濕熱和干熱反應(yīng)體系，且側(cè)重于蛋白質(zhì)的糖基化改性，食品加熱體系中的大分子美拉德反應(yīng)尚鮮見報道。

2.4 不同干燥階段LP的體外抗氧化活性

表3 不同干燥階段LP的體外抗氧化活性Table 3 Antioxidant activities in vitro of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

自由基清除能力以及還原能力是多糖抗氧化的重要機(jī)制[28]，以此評價不同干燥階段LP體外抗氧化活性。由表3可知，LP的抗氧化活性隨熱風(fēng)干燥時間的延長先增大后減小，其中LP-60的自由基清除能力及還原能力較強(qiáng)。采用Pearson雙側(cè)檢驗(yàn)分析LP不同抗氧化活性之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，IC25和FRAP之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05），但分別與IC50之間存在顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）的相關(guān)性。

多糖可作為電子供體，其提供的電子不僅能使Fe3+還原成Fe2+，同時能與自由基反應(yīng)，使自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)[29]。在熱風(fēng)干燥前60 h，LP抗氧化活性的增強(qiáng)可能與干熱環(huán)境下的多糖-蛋白質(zhì)美拉德反應(yīng)有關(guān)：多糖和蛋白質(zhì)通過美拉德反應(yīng)生成噻吩、噻唑、吡咯等雜環(huán)化合物，其電子非定域分布在環(huán)上，使碳原子上電子過剩，有利于自由基的親電加成，從而增強(qiáng)自由基的清除效果[30]；反應(yīng)產(chǎn)物具有疏水性，由它提供的氫原子易與DPPH自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的DPPH-H順磁分子，有助于對DPPH自由基的清除；反應(yīng)生成吡咯酮、還原酮類、脫氧果糖嗪等大分子中間產(chǎn)物，可為還原性物質(zhì)提供電子，增強(qiáng)Fe3+還原能力[31]。但熱風(fēng)干燥60 h后，具有抗氧化作用的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生降解和分子重排，使體系的抗氧化活性降低[32-33]。

2.5 不同干燥階段LP的體外抗腫瘤活性

圖4 不同干燥階段龍眼果肉中多糖的抗腫瘤活性Fig. 4 Antitumor activities of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

肝癌和胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國有逐年上升趨勢[34]，以胃癌細(xì)胞SGC7901和肝癌細(xì)胞HepG2為對象評價不同干燥階段LP的抗腫瘤活性，結(jié)果如圖4所示。隨著干燥時間的延長，LP的腫瘤細(xì)胞抑制活性大體呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，以LP-12、LP-24和LP-36的抗腫瘤活性相對較強(qiáng)。對于不同干燥階段LP，其高劑量（800 μg/mL）條件下的腫瘤細(xì)胞抑制率均顯著高于低劑量（200 μg/mL）（P＜0.05）。在高劑量條件下，LP-12和LP-24對HepG2細(xì)胞的生長抑制率無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于其他LP（P＜0.05）。LP-24和LP-36在高劑量條件下對SGC7901細(xì)胞抑制率無顯著差異（P＞0.05），但顯著弱于LP-12（P＜0.05）。

Meng Xin等[35]認(rèn)為，結(jié)合蛋白含量是影響多糖抗腫瘤作用的重要因素，其主要通過增加多糖分子中的正凈電荷，促使與腫瘤細(xì)胞膜負(fù)電荷受體之間的靜電相互作用，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞抑制效果。然而，多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合可能產(chǎn)生空間位阻，阻礙特異性配體的受體識別，使得腫瘤抑制活性減弱，這也可能是LP-60和LP-84腫瘤抑制活性較弱的原因。

2.6 不同干燥階段LP的體外免疫刺激活性

圖5 不同干燥階段龍眼果肉中多糖的巨噬細(xì)胞刺激活性Fig. 5 Macrophage-stimulating activities of polysaccharides from longan pulp at different drying stages

巨噬細(xì)胞是先天免疫體系的重要組成，其NO生成和TNF-α分泌是響應(yīng)多糖刺激的重要特征[36]，故以此考察不同干燥階段LP的體外免疫刺激活性，結(jié)果如圖5所示。相較空白組，LP均能有效刺激巨噬細(xì)胞NO生成和TNF-α分泌（P＜0.05），部分多糖的作用效果與5 μg/mL的LPS相當(dāng)。龍眼果肉干燥后，LP刺激巨噬細(xì)胞NO生成作用增強(qiáng)。在中、高劑量條件下，LP-0的NO生成量顯著低于其他LP（P＜0.05），而LP-12、LP-24、LP-36和LP-60的作用較為相近，且強(qiáng)于LP-84。對于刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α量，不同劑量條件下LP-0與LP-12并無顯著差異（P＞0.05），但強(qiáng)于LP-36、LP-60和LP-84。中、高劑量LP-24的巨噬細(xì)胞TNF-α分泌量顯著高于其他LP（包括5 μg/mL的LPS）（P＜0.05）。由此可見，龍眼果肉熱風(fēng)干燥24 h可以有效增強(qiáng)LP的免疫刺激活性。

Yi Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LP主要通過Toll樣受體4和2激活巨噬細(xì)胞。而LP與免疫細(xì)胞受體的直接相互作用（立體相互作用和電荷相互作用）或間接作用，與其相對分子質(zhì)量、結(jié)合蛋白、化學(xué)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象密切相關(guān)[37-40]。因此干燥過程中LP的相對分子質(zhì)量、結(jié)合蛋白含量及空間構(gòu)象的變化是影響其免疫調(diào)節(jié)活性的主要原因。

3 結(jié) 論

通過對不同干燥階段LP的基本組成、FTIR圖譜特征和相對分子質(zhì)量分布的研究，發(fā)現(xiàn)龍眼果肉在熱加工過程中多糖和蛋白質(zhì)相互作用，并推測主要由美拉德反應(yīng)所致。同時，比較這些LP的體外抗氧化活性、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性發(fā)現(xiàn)，果肉干制加工后的功能活性增強(qiáng)，但過度干制（在60 ℃條件下加熱84 h）后活性減弱。12～24 h的龍眼果肉熱風(fēng)干制有利于提升其多糖多方面的功能活性，其潛在的構(gòu)效機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究，本研究有助于為龍眼干肉的高品質(zhì)加工提供新的思路。

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Changes of Polysaccharides in Longan Pulp during Drying: Physicochemical Properties and Biological Activities

HAN Miaomiao1, YAO Juan1, YI Yang1,*, HUANG Fei2, WANG Limei3
(1. School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;2. Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture, Sericultural and Agri-Food Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China;
3. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

This work aimed to investigate the changes of polysaccharides in terms of physicochemical properties and biological activities during the drying of longan pulp. Polysaccharides from longan pulp at different drying stages were isolated.The proximate composition, Fourier transform infrared spectroscopic characteristics and molecular weight distribution of polysaccharides were analyzed, and their antioxidant, antitumor and immunostimulatory activities were evaluated in vitro. With the increase of drying time, the physicochemical characteristics of longan pulp polysaccharides (LP) showed significant changes.The mass ratio of neutral sugar to protein, the molar ratio of glucose to mannose and free amino group content were decreased,the typical amide bands in the infrared spectrum were diverse, and new fractions with relative high molecule weight were formed at the advanced stage of drying process according to the high-performance size-exclusion chromatogram. The evaluation of in vitro biological activities indicated that various activities of LP such as 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging,hydroxyl radical scavenging, ferric reducing antioxidant power increased after 12-60 h drying of longan pulp, inhibitory effects against tumor cells (HepG2 and SGC7901) and immunostimulating effects on nitric oxide production and tumor necrosis factor-alpha secretion in macrophages increased after 12-24 h drying of longan pulp. But the activities decreased after more than 60 h drying. These changes in activities might be related to the Maillard reaction between polysaccharides and proteins in longan pulp during drying. The results can be useful for the processing of dried longan pulp with high quality.

longan pulp; polysaccharide; physicochemical property; biological activity; Maillard reaction

2017-05-03

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31771979）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301416）；武漢輕工大學(xué)科研計劃項(xiàng)目（2016J05）

韓苗苗（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)。E-mail：18211673915@163.com

*通信作者：易陽（1986—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称?。E-mail：yiy86@whpu.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201721011

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