農(nóng)向+趙樂(lè)樂(lè)+曠歡

摘 要：紫莖澤蘭是菊科澤蘭屬的一種有毒植物，是我國(guó)外來(lái)入侵物種中危害最為嚴(yán)重的植物之一。紫莖澤蘭提取物對(duì)于組織器官中ATPase的活力是否有影響是本試驗(yàn)的目的。利用不同濃度的紫莖澤蘭提取液灌胃小白鼠以及溶解了避孕藥的菜籽油作對(duì)照，每隔5天取上一次灌胃的小鼠解剖取其肝臟制成組織勻漿，使用ATPase活力測(cè)定試劑盒和紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)得其吸光值，并由公式計(jì)算出其對(duì)應(yīng)的活力值，然后利用差異顯著性分析，得出F>f0.01，在正態(tài)分布圖中P<0.01，即紫莖澤蘭提取液對(duì)小鼠肝臟的ATPase活性是有極顯著的影響。

關(guān)鍵詞：紫莖澤蘭提取物 ；ATPase活力； 紫外-可見光分光光度計(jì)

紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）屬于雙子葉植物，菊目菊科澤蘭屬多年生草本或成半灌木狀植物。原產(chǎn)中美洲墨西哥和哥斯達(dá)黎加，是一種有毒的、侵占性很強(qiáng)的惡性雜草。目前，對(duì)紫莖澤蘭的毒性及中毒機(jī)理的研究雖然有一定進(jìn)展，但報(bào)道結(jié)論不夠一致。有研究表明紫莖澤蘭對(duì)棉鈴蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有不利影響；鮮紫莖澤蘭水提液對(duì)小鼠也有毒性。也有人認(rèn)為紫莖澤蘭乙醇提取物對(duì)小鼠沒有毒性。本試驗(yàn)從生物天然藥物的角度，探索紫莖澤蘭乙醇提取物對(duì)小鼠肝中ATPase活力是否有影響。

ATPase是細(xì)胞中利用ATP水解產(chǎn)生的能量產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化從而促進(jìn)離子進(jìn)行主動(dòng)跨膜運(yùn)輸?shù)囊环N酶，也稱為泵。其在小鼠肝臟中的主要作用是提供能量給器官進(jìn)行解毒。ATPase的變化說(shuō)明了其催化ATP水解產(chǎn)生能量的能力的變化，然而測(cè)定ATPase通常不能用重量和體積衡量，而是用酶活力大小來(lái)表示（即酶催化反應(yīng)的能力）。酶的活力越大，肝臟的解毒能力越強(qiáng)，反之，解毒能力越弱。近年來(lái)，在實(shí)驗(yàn)性高血壓動(dòng)物以及臨床高血壓患者的血清中觀察到了一種稱為利鈉激素（natriuretic hormone）的Na+K+泵抑制性液體因子。馮北元等研究得出乙醇對(duì)大鼠突觸體的兩類ATPase（Na+K+-ATPase和Mg2+-ATPase）均有抑制作用。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)應(yīng)用cDNA信息庫(kù)從動(dòng)物中獲得了Na+K+-ATPase亞基的克隆，所缺少的是新合成的亞基氨基端的信號(hào)肽。本次試驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)小鼠肝臟中ATPase活性的變化，來(lái)探究所灌胃藥物是否對(duì)小鼠臟器功能產(chǎn)生了影響，以及影響的程度。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

（1）紫莖澤蘭、左炔諾孕酮。紫莖澤蘭植株采于四川省西昌市，取樹陰下長(zhǎng)勢(shì)旺盛的紫莖澤蘭地上部分，烘干后粉碎并用乙醇制作提取液備用。植物形態(tài)學(xué)的鑒定按相關(guān)的鑒定文獻(xiàn)進(jìn)行。

左炔諾孕酮（正規(guī)藥店直接購(gòu)買華潤(rùn)紫竹藥業(yè)公司產(chǎn)品左炔諾孕酮炔雌醚）。

（2）小白鼠。從小鼠養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買成年健康小白鼠60只，分成4組，每組10只母鼠，5只公鼠。公母鼠分開喂養(yǎng)。

2.試驗(yàn)方法

（1）紫莖澤蘭提取液的制備。取粉碎的紫莖澤蘭100g，加入500ml，95%的乙醇在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上提取1h，過(guò)濾，萃取，濃縮，最后酒精蒸發(fā)完用丙三醇溶出殘?jiān)?，定容?/p>

（2）給藥方法。將紫莖澤蘭提取液分成兩組。第一組原始濃度灌胃，第二組加入相同體積超純水配成50%濃度的溶液灌胃，第三組灌胃相同體積的超純水作為對(duì)照，第四組灌胃菜籽油溶解的避孕藥（10ml）。體重稱量 小鼠體重均為50g左右（±2.5g）給藥濃度為0.1ml/10g體重·5d-1，每只小鼠使用灌胃針給藥0.5ml。第一次測(cè)定三組每組一只作為空白對(duì)照的吸光值，當(dāng)天灌胃第一次，以后每隔5天灌胃一次，灌胃之前取出三組每組一只測(cè)定吸光值。連續(xù)灌胃3次，測(cè)定數(shù)據(jù)5次（外加一次恢復(fù)試驗(yàn)）。

（3）樣品制備。每組取一只小鼠，在無(wú)菌環(huán)境下解剖，快速取其肝臟，用人工研磨方法，在冰塊上充分研磨，并按照1：9比例加入超純水混勻，各取2ml組織勻漿于EP管內(nèi)， 2500r/min離心10min。取上清液先測(cè)定組織蛋白含量，然后測(cè)定肝臟ATPase的吸光值。

（4）數(shù)據(jù)處理。測(cè)得每組吸光值根據(jù)公式計(jì)算出對(duì)應(yīng)的組織蛋白含量和ATPase活力。并利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)方差分析：可重復(fù)雙因素分析在office中確定差異的顯著性。

二、結(jié)果與分析

1.三組藥物影響肝臟ATPase活力顯著性分析

表1中，不同藥物對(duì)肝臟的影響數(shù)據(jù)中，df1=2，dfe=6，f0.05=5.14，f0.01=10.92，F(xiàn)1>f0.01，則P<0.01，表明同一時(shí)間段內(nèi)不同藥物對(duì)肝的影響差異極顯著；不同持續(xù)時(shí)間段內(nèi)對(duì)肝的影響數(shù)據(jù)中，df1=3，dfe=6，f0.05=4.76，f0.01=9.78，F(xiàn)2>f0.01，則P<0.01，表明不同持續(xù)時(shí)間段內(nèi)同一藥物對(duì)肝的影響差異極顯著。

綜合來(lái)說(shuō)，根據(jù)上表F值，并查表對(duì)比，F(xiàn)值遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)表值，即在正態(tài)分布圖上P<0.01，概率為99.9%，差異極顯著。

2.得到的結(jié)論

（1）對(duì)于同一種ATPase的活性，在灌胃持續(xù)期間，每一次相對(duì)于之前一次的活性都具有顯著性差異，即每次喂藥都有99.9%的概率使其對(duì)應(yīng)的ATPase活性產(chǎn)生變化；

（2）對(duì)于同一次灌胃的三種藥物之間，同一灌胃時(shí)間其活力值相對(duì)于另一種藥物的活力值也都具有顯著性的差異，即每一次喂藥，灌胃三種藥物的器官活性都會(huì)有99.9%的概率產(chǎn)生變化。

3.每組小鼠器官中四種ATPase離子泵的活力變化曲線圖建立

（橫坐標(biāo)：日期，縱坐標(biāo)：活力值）（Z+代表紫莖澤蘭提取液原始濃度；Z-代表紫莖澤蘭原始提取液稀釋一倍的度；B代表避孕藥的菜籽油溶液）

根據(jù)圖1中曲線圖走向，可知肝臟中Na+K+-ATPase對(duì)Z+的應(yīng)激反應(yīng)特別強(qiáng)烈，其活性突然增大，但在第二次灌胃以后便降低到正常水平，之后活力也基本沒有變化，穩(wěn)定在正常水平。Z-和B的趨勢(shì)大概都是灌胃后ATPase活力增強(qiáng)與減弱互相交替中進(jìn)行，且變化幅度相比于Z+的影響不大，直至最后一次恢復(fù)試驗(yàn)都回到正常水平附近。endprint

根據(jù)圖2曲線圖走勢(shì)可以看出，Z+在第一次灌胃后對(duì)肝臟Mg2+-ATPase活力的影響與圖五相同，但第二次及以后直到恢復(fù)性試驗(yàn)，Mg2+-ATPase活力都在緩慢下降，降到了正常水平之下，并且沒有恢復(fù)正?；盍?。Z-與圖1中Z-的影響趨勢(shì)相同。但是B對(duì)Mg2+-ATPase的影響卻是先逐漸下降而后緩慢上升，變化水平很小，貼近正常水平。

圖3中三種藥物對(duì)肝臟Ca2+-ATPase的影響趨勢(shì)基本與圖五中Na+K+-ATPase的影響趨勢(shì)相同。不過(guò)Z+的影響使得Ca2+-ATPase的活力在第二次灌胃后依舊處于緩慢下降，并且降到了正常水平之下。

圖4中Z+對(duì)肝臟中Ca2+Mg2+-ATPase活力的整體影響依舊使其下降到了正常水平之下，而Z-和B在第一次灌胃后對(duì)ATPase基本沒產(chǎn)生影響，但在第二次灌胃后其活性都突然下降，幅度很大，之后卻一直在上升，并且恢復(fù)到了正常的活力水平附近。

綜上，可得出，三種藥物中，Z+對(duì)肝臟中四種ATPase的活力影響最為明顯，而且可以持續(xù)的使其活力明顯下降，而Z-及B對(duì)其活性的影響不穩(wěn)定，并且停止灌胃后都可以恢復(fù)到正常活力水平。

根據(jù)表中方差交互值和圖表分析結(jié)論可得，紫莖澤蘭提取物對(duì)小鼠肝中ATPase活力產(chǎn)生了影響，并且每種藥物的影響程度不同。有人得出女貞子提取物對(duì)小鼠Na+K+-ATPase活力產(chǎn)生了促進(jìn)作用，延長(zhǎng)其活力持續(xù)時(shí)間，并且藥效時(shí)間結(jié)束后，其活性顯著降低到正常水平以下。而研究表明垂盆草及竹葉提取物也有相同提高臟器ATPase活力的功效。在實(shí)驗(yàn)中，小鼠臟器ATPase活性也產(chǎn)生了同樣的影響，因此可以得出灌胃的紫莖澤蘭提取物對(duì)小鼠臟器ATPase活力有影響，并且不同的濃度影響不同。根據(jù)董強(qiáng)等人的紫莖澤蘭全草小鼠毒性的研究中得出的紫莖澤蘭全草提取物中含有多種致毒有效成分，并且互相作用，因此在本實(shí)驗(yàn)中可知，對(duì)于肝臟紫荊澤蘭提取物原始濃度對(duì)其影響效果強(qiáng)，對(duì)于腎臟，避孕藥菜籽油溶液對(duì)其影響效果較強(qiáng)。但是紫莖澤蘭提取物并不能永久有效的使肝、腎臟中ATPase產(chǎn)生變化，起影響作用只是在持續(xù)給藥期間，中斷給藥，則會(huì)恢復(fù)到正常狀態(tài)。

三、討論

對(duì)于肝臟的四種ATPase的活性，Z+所引起的應(yīng)激反應(yīng)是最為強(qiáng)烈的，而且后續(xù)灌胃之后，其能夠持續(xù)的影響肝臟內(nèi)ATPase的活性，從而達(dá)到長(zhǎng)期影響的效果，但缺點(diǎn)是必須堅(jiān)持給藥，一旦中斷灌胃，那么肝臟的ATPase活性就會(huì)立即回復(fù)到正常的水平。

4張圖表從三種藥物對(duì)小鼠不同的器官及同一器官內(nèi)不同的ATPase的活性影響趨勢(shì)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)為ATPase的吸光值，可用來(lái)表示其活性的大小，更加直觀的體現(xiàn)出不同藥物的影響變化，從感官方面佐證了我們的結(jié)論，并且為接下來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析做出了鋪墊。

在解剖小鼠進(jìn)行組織勻漿的制備過(guò)程中，我們還進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查。初次解剖（8.3日）的小鼠肝臟腎臟外觀良好，無(wú)異常腫脹、萎縮或者病變。然而在第二次解剖時(shí)（8.10日）及之后到第四次（8.22日）解剖，小鼠的肝臟腎臟外觀明顯有變化，肝臟腫脹，并且有黃色脂肪塊覆蓋，腎臟逐漸萎縮，顏色變暗淡，并且彈性下降。

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