項(xiàng)新 馮振偉 陸玲娜 何坤 施燕春

·論著·

TNFα基因-308A/G多態(tài)性與原發(fā)性腎病綜合征的相關(guān)性研究

項(xiàng)新 馮振偉 陸玲娜 何坤 施燕春

目的探討TNF-α基因-308A/G多態(tài)性與原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)臨床和病理的相關(guān)性。方法利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法來(lái)鑒定基因型，以檢測(cè)PNS患者和對(duì)照組TNF-α基因-308A/G多態(tài)性分布規(guī)律。收集一般臨床指標(biāo)和PNS患者的病理資料，檢測(cè)患者治療前血清TNF-α，進(jìn)行病例對(duì)照研究與臨床病理資料分析。結(jié)果PNS患者和對(duì)照組均檢出A、G2種TNF-α-308A/G等位基因，3種組合基因型AA型、AG型、GG型。2種等位基因和3種基因型在2組分布頻率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。PNS組患者的年齡、性別、血脂、白蛋白、尿素氮、血肌酐和C反應(yīng)蛋白水平中任何基因型的分布頻率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，攜帶GG基因型的PNS患者的24h尿蛋白水平較AG和AA基因型明顯減少(P均<0.05)。攜帶AA基因型患者血清TNF-α水平較AG和GG基因型明顯升高(P均<0.05)。病理結(jié)果顯示：AA基因型在微小病變型腎病患者中有較高的出現(xiàn)頻率，與GG+AG基因型比較有顯著性差異(P<0.05)。GG基因型和G等位基因的PNS患者治療有效率明顯高于其他基因型(P均<0.05)。結(jié)論TNF-α-308A/G基因多態(tài)性能影響血清TNF-α水平，可能與微小病變型腎病的發(fā)病、較重的蛋白尿及激素療效相關(guān), 但與PNS的發(fā)病易感性不相關(guān)。

腫瘤壞死因子α；原發(fā)性腎病綜合征；基因多態(tài)性

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

選擇2014年1月至2016年12月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院腎內(nèi)科住院的PNS患者共75例，符合腎病綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)：24h尿蛋白>3.5 g/d，血清蛋白<30 g/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①所有繼發(fā)型腎病綜合征患者；②合并感染者，包括全身或局部的真菌、細(xì)菌、支原體等感染；③惡性腫瘤患者，包括各種血液病和實(shí)體瘤；④存在組織或器官損傷者，包括近期有創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)、心肌梗死等病史；⑤輸注白蛋白或血漿等影響血清蛋白濃度者；⑥患自身免疫性疾病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。PNS患者設(shè)為PNS組，所有病例均行腎穿刺活檢，且在入院前2周內(nèi)沒(méi)有應(yīng)用激素類藥物，其中女30例，男45例，年齡18～69歲，平均年齡(36.9±11.3)歲。75例PNS患者病理類型：微小病變型腎病9例，系膜增生性腎小球腎炎21例，局灶性節(jié)段性腎小球硬化15例，膜增生性腎小球腎炎12例，膜性腎病18例。對(duì)照組共40例，選自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院健康體檢者，女16例，男24例，年齡17～65歲，平均年齡(38.4±8.9)歲。2組年齡、性別比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，有可比性。本研究方案獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1.提取基因組DNA 抽取外周抗凝血5 ml，嚴(yán)格按照DAN提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取。

2.TNF-α基因-308A/G基因型的鑒定 引物設(shè)計(jì)與合成：在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中找到TNF-α基因序列并使用其在線引物設(shè)計(jì)功能設(shè)計(jì)引物，上游引物序列5‘-AAGCCCCTCCCAGTTCTAGT -3’,下游引物序列5‘- TGGTGGAGAAACCCATGAGC -3’。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)條件：94℃預(yù)變性5 min；再按下列程序循環(huán)35次，即94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min；末次循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體積為30 μl，NcoI限制性內(nèi)切酶37℃水浴消化，用1.5%凝膠電泳分帶，確定基因型。隨機(jī)從2組中每個(gè)基因型選取20個(gè)樣品，PCR產(chǎn)物50 ul，由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，進(jìn)一步確定變異堿基及其位置。

3.觀察指標(biāo) 收集PNS組治療前C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、24h尿蛋白定量、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(albumin，Alb)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)及腎臟病理資料，且實(shí)驗(yàn)室用ELISA試劑盒檢測(cè)PNS組治療前血清TNF-α。

4.治療方法 治療組完善相關(guān)檢查，明確無(wú)使用激素禁忌癥，用潑尼松1 mg·kg-1·d-1治療8周。

綠色科技創(chuàng)新突破了傳統(tǒng)科技創(chuàng)新的內(nèi)涵，是緊緊圍繞可持續(xù)發(fā)展的思想，充分考慮科技創(chuàng)新所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益、生態(tài)效益，會(huì)使綠色科技創(chuàng)新成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的核心依托。

5.療效評(píng)定 治療有效：治療8周后臨床癥狀消失，且24h尿蛋白定量較前下降50%以上，血漿Alb升高，腎功能穩(wěn)定。治療無(wú)效：治療8周后臨床癥狀無(wú)改善，且仍為腎病綜合征或24h尿蛋白定量下降未達(dá)到治療前的一半，腎功能無(wú)變化或惡化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料的組間構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性分析采用Spearman’s相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)群體代表性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TNF-α基因-308A/G基因型分析

TNF-α-308A/G多態(tài)性的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為341 bp ，經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳鑒定，選擇擴(kuò)增產(chǎn)物含量較高，特異性好者進(jìn)一步采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法進(jìn)行分析。在擴(kuò)增片段上有308 A/G單核苷酸多態(tài)性，酶切后AG型則為3條片段，GG型產(chǎn)生2條片段，AA型為1條片段。直接測(cè)序結(jié)果與此結(jié)果一致。(圖1～3)

1為DNAMarkerDL5000;2,3,4,5,6,7,8,9為未酶切前的TNF-α(-308A/G)產(chǎn)物圖1 PCR產(chǎn)物

3、5、6、8為AG基因型,包括341bp、224bp、117bp片段;2、4、7、9為AA基因型,包括341bp片段;10為GG基因型,包括224bp、117bp片段;1為DNAmarker2000圖2 TNF-α基因-308A/G多態(tài)性酶切

A為GG基因型,B為AA基因型,C為AG基因型圖3 TNF-α基因-308A/G的部分序列

二、病例-對(duì)照研究

PNS患者和對(duì)照組均檢出A、G兩種TNF-α-308A/G等位基因，3種組合基因型AA型、AG型、CG型。2種等位基因和3種基因型在2組分布頻率無(wú)顯著差異(P>0.05)。(表1)

表1 2組TNF-α-308A/G基因型和等位 基因分布頻率比較 [例(%)]

三、臨床分析

PNS組TNF-α-308A/G基因型的分布頻率在性別與年齡方面無(wú)明顯偏倚，AA基因型患者的血清TNF-α水平較AG和GG基因型患者明顯升高(均P<0.05),GG基因型患者的24h尿蛋白水平較AG和AA基因型患者明顯降低(均P<0.05)，血脂、Alb、BUN、SCr和CRP水平在3種基因型中無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(表2)

表2 PNS組TNF-α-308A/G基因多態(tài)性與PNS 臨床的相關(guān)性

注：與GG型比較，aP<0.05；與AA型比較，bP<0.05

四、病理分析

PNS患者中，微小病變型腎病患者的AA基因型頻率高于非微小病變型腎病患者，與AG+GG基因型之間比較有顯著性差異(P<0.05)；系膜增生性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎、膜性腎病及局灶性節(jié)段性腎小球硬化患者中基因型頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(表3)

表3 TNF-α-308A/G 基因多態(tài)性與PNS病理的相關(guān)性(例)

注：與AA型比較，aP<0.05

五、療效評(píng)定

治療8周后，PNS患者中治療有效的有36例，治療無(wú)效的有39例。治療有效組患者的GG基因型頻率明顯高于治療無(wú)效組，治療有效與無(wú)效組患者等位基因分布頻率比較有顯著性差異(P<0.05)。(表4)

表4 TNF-α-308A/G基因多態(tài)性與PNS療效的 相關(guān)性 [例(%)]

注：與GG型比較，aP<0.05；與G等位基因比較，bP<0.05

討 論

TNF-α是參與機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，主要由單核巨噬細(xì)胞(mononuclear phagocyte，MP)和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[5]，大量研究表明在幾乎所有原發(fā)性和繼發(fā)性腎病綜合征的腎小球內(nèi)均有MP浸潤(rùn)并參與介導(dǎo)腎小球損傷。在原發(fā)性腎小球疾病患者中MP是主要炎癥細(xì)胞，腎臟內(nèi)多種細(xì)胞均可分泌TNF-α，如血管平滑肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞。研究已發(fā)現(xiàn)TNF-α能直接或間接作用于腎小球系膜細(xì)胞，刺激系膜細(xì)胞增殖和硬化[6]。體外實(shí)驗(yàn)表明TNF-α可使培養(yǎng)的人足突細(xì)胞骨架改變，可能是一種重要的腎小球組織損傷介質(zhì)，在腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7-10]。多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)TNF-α可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的蛋白尿明顯增加、出現(xiàn)腎功能減退和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)加劇，而再用TNF-α的可溶性受體或抗TNF-α抗體處理后尿蛋白減少，腎小球血栓及中性白細(xì)胞浸潤(rùn)也明顯改善[11-13]。隨著對(duì)細(xì)胞因子在腎病發(fā)生發(fā)展中的進(jìn)一步深入研究，充分顯示TNF-α是其中關(guān)鍵的一個(gè)細(xì)胞因子。TNF-α可能與兒童PNS患者腎臟病理類型及激素抵抗有關(guān)[14-15]，說(shuō)明TNF-α在PNS發(fā)病中確實(shí)起著非常重要的作用。

TNF-α基因位于人染色體6p21.1-p22，具有遺傳多態(tài)性，TNF-α基因多態(tài)性位點(diǎn)主要出現(xiàn)在其啟動(dòng)子上游部分區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游308位點(diǎn)存在G→A的替代[16]，TNF-α基因多態(tài)性能影響 TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄，有證據(jù)表明TNF-α通過(guò)正反饋來(lái)增加它的分泌[17]。因此，在不同個(gè)體攜帶TNF-α-308位點(diǎn)基因型的不同，導(dǎo)致TNF-α的分泌濃度有差異，僅較小的濃度差異就可能通過(guò)自身放大效應(yīng)影響最終炎性反應(yīng)的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示：TNF-α-308A/G基因型和等位基因的分布頻率在成人PNS患者與健康對(duì)照人群中無(wú)顯著性差異，不支持此位點(diǎn)與PNS的遺傳易感性有相關(guān)關(guān)系。Kim等[18]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α-G308A多態(tài)性與兒童PNS易感性不相關(guān)。但Jafar等[19]和Tripathi等[20]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α-308AA基因型可能與兒童PNS的易感性相關(guān)。以上TNF-α-G308A多態(tài)性與兒童PNS遺傳易感性研究結(jié)果不一致可能與種族、樣本量、性別等因素影響有關(guān)，有待積累更多的臨床資料進(jìn)行多中心大樣本的研究探討。

臨床分析結(jié)果顯示： AA基因型的PNS患者組的血清TNF-α較AG和GG基因型患者組明顯升高， 提示AA基因型有更高水平的血清TNF-α表達(dá)，國(guó)外關(guān)于TNF-α-G308A多態(tài)性對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的影響研究表明TNF-α-308A等位基因能夠增強(qiáng)TNF-α的轉(zhuǎn)錄[4]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。GG基因型的PNS患者的尿蛋白較AG和AA基因型患者明顯減少，提示含有A等位基因的患者更容易表現(xiàn)為較重的蛋白尿，說(shuō)明攜帶A等位基因患者腎小球損傷較重，與增加血清TNF-α水平后導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞損傷有關(guān)。AA、AG和GG基因型在PNS患者的年齡、性別、BUN、SCr、Alb、血脂、CRP水平中比較無(wú)顯著性差異，提示3種基因型的PNS患者在這些臨床表現(xiàn)方面可能差別不明顯。

本研究病理分析顯示微小病變型腎病患者的AA基因型頻率高于非微小病變型腎病患者，GG基因型的分布頻率明顯降低，提示GG基因型可能有保護(hù)性作用。微小病變型腎病的病理特點(diǎn)為彌漫性上皮細(xì)胞足突消失，腎小球基本正常，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，其發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞功能異常有關(guān)，T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞樣物質(zhì)作用于上皮細(xì)胞，導(dǎo)致足突消失和蛋白尿形成?？梢酝茰y(cè)，微小病變型腎病患者腎組織局部如存在功能異常T細(xì)胞,被致病抗原激活后，其TNF-α-308AA基因型產(chǎn)生高水平的TNF-α，進(jìn)而直接或通過(guò)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子生成和激活免疫系統(tǒng)，作用于腎小球上皮細(xì)胞，導(dǎo)致足突融合，大量蛋白尿產(chǎn)生，提示AA基因型與微小病變型腎病發(fā)病相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)任何基因型的分布頻率在其他4種病理類型有差異，提示TNF-α-G308A基因多態(tài)性可能與這些病理改變關(guān)系不大。

本研究發(fā)現(xiàn)，GG基因型和G等位基因的PNS患者治療有效率高，對(duì)激素療效好，病情容易控制，可能與AA基因型和A等位基因跟激素耐藥有一定關(guān)系，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)TNF-α-308AA基因型可能與兒童PNS激素耐藥相關(guān)[19-20]，與本研究結(jié)果一致，因而TNF-α-G308A基因可作為判斷激素療效的一個(gè)遺傳學(xué)標(biāo)志。

TNF-α-308A/G基因多態(tài)性能影響血清TNF-α水平，可能與微小病變型腎病的發(fā)病、較重的蛋白尿及激素療效相關(guān)，但與PNS的發(fā)病易感性不相關(guān)。

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RelationshipofTNFα-308A/Gpolymorphismwithprimarynephroticsyndrome

XIANGXin，F(xiàn)ENGZhen-wei，LULing-na，HEKun，SHIYan-chun.

DepartmentofNephrology，AffiliatedMinzuHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530001,China

FENGZhen-wei，E-mail：fzw123@126.com

ObjectiveTo investigate the clinicopathological relationship of TNFα-308A/G polymorphism with primary nephrotic syndrome (PNS), and the causes of PNS from gene level.MethodsThe genotypes were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment-length polymorphism to find the regularity of distribution of TNFα-308A/G polymorphism in normal control subjects and the patients with PNS. At the same time, general clinic indexes and patients’ pathologic information were collected to make control study and clinicopathologic analysis.ResultsTNFα-308A/G including 3 genotypes (AA, AG and GG) and 2 allele genes (A or G) were found in both two groups. There were no significant differences in genotypes distribution, and allele frequency between PNS and normal control subjects (P>0.05). No correlation was found in the -308A/G polymorphism of TNFα with sex, age, Alb, CHOL, TG, BUN, SCr and CRP levels. The albuminuria level of GG genotype was lower than that of AG or AA genotypes (P<0.05), and the TNFα level of AA genotype was higher than that of AG or GG genotypes (P<0.05). The pathologic data showed that the AA genotype frequency was higher than GG+AG genotype frequency in patients with minimal change nephrotic syndrome (P<0.05). The effective rate of PNS with GG genotype and G allele both was higher than that of the other genotypes (P<0.05).ConclusionsTNFα-308A/G polymorphism was associated with the TNFα level, and may be associated with severe albuminuria and minimal change nephrotic syndrome and the curative effect of hormone. However, this polymorphism was not associated with susceptibility to PNS.

Tumor necrosis factor alpha; Primary nephrotic syndrome; Polymorphism

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.10.002

廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.GXMUYSF201338)

530001 南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院腎內(nèi)科

馮振偉，E-mail：fzw123@126.com

2017-06-08

2017-09-26)