孫傳伯，趙 群，陳存武，陳乃富，韓邦興

(皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012)

一株漫水河百合內(nèi)生菌的分離、鑒定及代謝產(chǎn)物活性研究

孫傳伯，趙 群，陳存武，陳乃富，韓邦興

(皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012)

以安徽省霍山縣漫水河百合健康新鮮鱗莖為研究對象，經(jīng)過分離純化篩選出一株內(nèi)生菌株BF2，經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定BF2菌株屬于散囊菌目踝節(jié)菌屬Talaromyce；采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化組合發(fā)酵，代謝產(chǎn)物通過濾紙片法得到對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌最大抑制圈分別為3.05 cm和3.26 cm，最佳培養(yǎng)基組合為：NaNO30.6 g；胰蛋白胨2 g；葡萄糖25 g和(NH4)2SO41.5 g。

百合；內(nèi)生菌；鑒定

百合(Lily)是單子葉植物亞綱，為百合科(Liliaceae)百合屬多年生草本球根植物[1]。全世界野生百合有96個(gè)種，而原產(chǎn)中國的就有47 個(gè)種、18個(gè)變種，其中36個(gè)種、15個(gè)變種更是為中國所特有[2](P3)。百合的花具有觀賞價(jià)值，其鱗莖又能食用和入藥，是一種名貴的藥食同源植物[3](P7),[4]。

安徽省霍山縣漫水河鎮(zhèn)地處大別山腹地深山區(qū)，素有“百合之鄉(xiāng)”美譽(yù)。因此獨(dú)特地理環(huán)境造就其漫水河百合具有極高的藥用價(jià)值，其鱗莖色白、肉嫩、個(gè)大、純天然，味微甘，對于治療喉炎、肺結(jié)核、肝炎和高血壓等病癥有較好效果；其多糖含量高，具有抗氧化、清除羥自由基、增強(qiáng)免疫功能的活性功能，是清補(bǔ)保健之佳品[5-11]。

近年來，對植物內(nèi)生菌的研究表明，植物體的實(shí)際生存狀態(tài)是微生物和植物的共生狀態(tài)，是微生物在宿主植物體內(nèi)的協(xié)同作用及其所產(chǎn)生的新功能和新物質(zhì)[12]。同時(shí)內(nèi)生菌對藥用植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、宿主活性代謝物積累、抗逆性、植物生物活性、應(yīng)對環(huán)境氣候變化等作用顯著[13]。本文以漫水河百合新鮮健康鱗莖為實(shí)驗(yàn)材料，分離其可培養(yǎng)內(nèi)生物微生物，以期為漫水河百合產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 百合樣品來源

實(shí)驗(yàn)對象：漫水河百合球莖(采購于霍山漫水河)

1．1．2 主要試劑

無水乙醇，75%乙醇，瓊脂，葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨，升汞，胰蛋白胨，KNO3，NH4Cl，NaNO3，(NH4)2SO4，NaOH，HCl，蔗糖等，試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．1．3 供試病原菌

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(皖西學(xué)院生物工程教研室提供)

1．1．4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯∶葡萄糖∶瓊脂∶水=10 g∶1 g∶1 g∶50 ml。 121 ℃濕熱滅菌20 min備用。

1．1．5 主要設(shè)備

超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-1B/1BU)、恒溫培養(yǎng)箱(太倉市科教器材廠DHP-9162)、恒溫?fù)u床(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 TH2-C)、電泳槽(北京六一儀器廠DYCP-31DN)、穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠DYY-5)、 電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司DK-8D)、凝膠成像儀(北京百晶AUTO710)、PCR儀(Applied Biosystems 2720 thermal cycler)、冷凍高速離心機(jī)(BBI HC-2518R Surf)精密單道可調(diào)移液器(eppendorf)。

1．2 內(nèi)生真菌分離方法

外植體消毒：用清水沖凈百合鱗莖表面泥沙后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺→1%升汞浸泡3 min→無菌水洗滌5次→75%乙醇浸泡2 min→無菌水清洗5～8次。

真菌培養(yǎng)：將處理好的樣品(將百合瓣切開，然后將切開面放置于培養(yǎng)基上)置于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，對照組為最后一次無菌洗滌水涂布平板；培養(yǎng)3～4天后切開面有菌絲長出，與對照組進(jìn)行比較，確認(rèn)的內(nèi)生菌轉(zhuǎn)接到斜面試管培養(yǎng)，并于4 ℃保存。

1．3 目標(biāo)菌株篩選

將帶有發(fā)酵活性產(chǎn)物直徑為8 mm的濾紙圓片放在涂布好供試病原菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)3天，觀察其抑菌圈情況，具體操作方法參考文獻(xiàn)[14]。

1．4 內(nèi)生真菌分子鑒定

純化備用的試管菌株制備成菌懸液，PCR體系如下：1)基因組DNA提取采用上海生工生物工程公司SK8259(真菌)試劑盒進(jìn)行提??；2)PCR擴(kuò)增，上游引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG下游引物ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；3)PCR反應(yīng)體系：Template(基因組 DNA 20～50 ng/μl)0.5 μl，10×Buffer(with Mg2+)2.5 μl，dNTP(各 2.5 mM) 1 μl，酶0.2 μl，F(xiàn)(10 uM)0.5 μl，R(10 uM)0.5 μl，加雙蒸水至25 μl；4)PCR反應(yīng)體系：a)預(yù)變性94 ℃ 4 min；b)變性94 ℃ 45 s；c)復(fù)性(退火) 55 ℃ 45 s；d)延伸72 ℃ 1 min；e)步驟b)～d)循環(huán)30次；f)修復(fù)延伸72 ℃ 10 min后終止反應(yīng)，4 ℃保溫。

把提取到內(nèi)生真菌DNA序列送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，獲得待確定物種的1條ITS序列，測得的序列數(shù)據(jù)在 NCBI 上 blast 比對，搜索同源序列，在系統(tǒng)中查出相應(yīng)微生物，并挑選與靶序列最相近的參考序列，構(gòu)建反映待確定物種(undetermined species)和相關(guān)屬之間親緣關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用軟件Clustal X 1．81對內(nèi)群和外群的ITS序列進(jìn)行比對和排序，用軟件BioEdit 7．0．9．0對相應(yīng)序列進(jìn)行編輯。以ITS序列為分子標(biāo)記，用貝葉斯法(Bayesian inference， BI)和簡約法(maximum parsimony， MP)對待確定物種進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．6 代謝產(chǎn)物活性研究

試驗(yàn)中固定了發(fā)酵溫度25 ℃、初始pH為自然，然后設(shè)計(jì)4因素3水平(見下表1)的培養(yǎng)基(1 000 ml)對分離到的菌株BF2進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，活性物質(zhì)測定采用濾紙片法，具體方法見參考文獻(xiàn)[14]，每組試驗(yàn)設(shè)3組平行，測定結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)對照組采用培養(yǎng)基配置相同，配置完成后不發(fā)酵立即進(jìn)行冷藏，同樣用濾紙片法測定抑菌圈。

表1 因素水平簡表

2 結(jié)果

2．1 內(nèi)生菌平板菌落特征

本次實(shí)驗(yàn)共分離真菌類7株，經(jīng)過對兩種指示菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)，得到編號為BF2菌株對兩種病原菌具有抑菌效果見下圖1、圖2，表2為BF2菌株平板菌落生物學(xué)形態(tài)特征。

圖1 BF2對大腸桿菌抑菌圈

圖2 BF2對金黃色葡萄球菌抑菌圈

菌株含水量形態(tài)正反差別透明度結(jié)合度菌落顏色BF2干燥質(zhì)地均勻無差別不透明不緊密表面白色,內(nèi)部淺綠色

2．2 內(nèi)生菌測序及分子鑒定

提取BF2菌株的DNA送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。經(jīng)過檢測得到的堿基對是517bp(Seq1)：GCACCTCCCACCCTTGTCTCT ATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGG CCACCTGGTCGCCGGGGGACATCTGTCCCCGG GCCCGCGCCCGCCGAAGCGCTCTGTGAACCCT GATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTATGAAA ATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTG GTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGA GCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGT GTTGGGTGCGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGA AAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAG CGTATGGGGCTTTGTCACTCGCTCGGGAAGGA CTGGCGGGGGTTGGTCACCACCAAAATTTTAC CACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACC CGCTGAACTTAAGCATATCAT。其序列登陸B(tài)LAST系統(tǒng)進(jìn)行比對，結(jié)果如下表3。

表3 BF2菌株序列Blast 結(jié)果

2．3 BF2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

2．3．1 序列分析

內(nèi)群和外群的ITS部分同源片段序列經(jīng)過比對和編輯后，序列片斷的長度為539 bp(包括Gap)，有317個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約性信息位點(diǎn)有229個(gè)。所有序列的平均G+C含量為55.8%。

2．3．2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通過BI法和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，其系統(tǒng)樹主干部分一致，見下圖3。結(jié)果表明，待確定分離菌株與散囊菌目Eurotiales的Talaromycespurpureogenus、Penicilliumsp．、Talaromycesamestolkiae、Talaromycesruber和Talaromycespinophilus等物種共享1個(gè)單倍型(Hap3)；并且與散囊菌目的所有單倍型形成了1個(gè)支持度極好的分支(PP=0.99， BS=96)，形成單系。

圖3 BF2菌株ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

又由于待確定分離菌株與散囊菌目中共享1個(gè)單倍型物種分別屬于踝節(jié)菌屬Talaromyces和青霉屬Penicillium，所以該物種很可能屬于踝節(jié)菌屬或青霉屬。考慮到在實(shí)驗(yàn)材料是健康的百合鱗莖，并在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格去除了青霉屬真菌的污染；又根據(jù)表2中平板菌落生物學(xué)特征，因此可判定該物種屬于踝節(jié)菌屬。從已發(fā)表的文獻(xiàn)資料[15]表明，從紅豆杉中分離的踝節(jié)菌屬Talaromyces能產(chǎn)功能性活性物質(zhì)。因此本文針對分離到的踝節(jié)菌屬目標(biāo)菌株BF2進(jìn)行代謝產(chǎn)物活性研究。

2．4 產(chǎn)物活性研究

通過4因素3水平正交發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過濾紙片法在平板上形成抑菌圈的直徑進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其對照組沒有形成抑菌圈。從表4中可以看出所有發(fā)酵組的紙片在平板上都能形成抑菌圈，說明BF2菌株代謝產(chǎn)物中含有抑菌活性成分；其中序號7的培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物活性最高，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都行產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑分別為3.26 cm和3.05 cm。其最優(yōu)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵組配方是A3B1C3D2，即最優(yōu)活性產(chǎn)物培養(yǎng)基配方(1 000 ml)為：NaNO30.6 g，胰蛋白胨2 g，葡萄糖25 g和(NH4)2SO41.5 g。

表4 產(chǎn)物活性抑菌結(jié)果一覽表

3 結(jié)論與討論

通過對待定分離菌株與相關(guān)類群的ITS分析，可知待定分離菌株與散囊菌目的所有單倍型聚合為支持度極好的分支(PP=0.99， BS=96)，形成單系。因此，該待確定分離菌株屬于散囊菌目。

從漫水河百合健康鱗莖中分離到一株內(nèi)生真菌BF2，通過平板生物學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定BF2菌株屬于散囊菌目踝節(jié)菌屬Talaromyce；通過4因素3水平的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，可得到其代謝活性產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都行產(chǎn)生抑制作用，其中第七組產(chǎn)抑菌圈直徑最大分別為3.26 cm和3.05 cm；其最優(yōu)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵組配方(1000ml)是NaNO30.6 g，胰蛋白胨2 g，葡萄糖25 g和(NH4)2SO41.5 g。

李良群等[15]從云南紅豆杉內(nèi)生真菌TalaromyceSP．T1BF的發(fā)酵物中分離到4個(gè)功能化合物都具有抗腫瘤成分，說明內(nèi)生真菌TalaromyceSP．可以產(chǎn)生具有藥用價(jià)值的活性成分。顏華等[16-20]從藥用植物中分離的內(nèi)生真菌對病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用或能產(chǎn)功能性活性物質(zhì)。本研究分離的漫水河百合內(nèi)生真菌屬于踝節(jié)菌屬Talaromyce;從代謝活性物質(zhì)抑菌來看具有顯著的效果，目前尚未確定其活性物質(zhì)成分，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明；漫水河百合具有較高的藥用價(jià)值，但其藥效與內(nèi)生菌之間的互作關(guān)系得研究鮮有報(bào)到，因此對內(nèi)生真菌與其藥用價(jià)值之間的關(guān)系研究具有較強(qiáng)的理論意義，是下一步研究重點(diǎn)內(nèi)容。

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Isolation,IdentificationandAntimicrobialActivityofMetabolitesofEndophytesfromtheLilyPlantintheManshuihe

SUN Chuanbo, ZHAO Qun, CHEN Cunwu, CHEN Naifu, HAN Bangxing

(CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity，Lu’an237012，China)

An endophytic strain named BF2 was isolated and purified from the healthy and fresh bulbs of the lily in the Manshuihe in Huoshan, Anhui province, and the strain was identified to belong to theTalaromycegenus of Eurotiales according to colonial morphology and Molecular biology methods. The optimum combination ferments were adopted using orthogonal experiment, and the maximum inhibition loops formed by the metabolites againstE.coliandStaphylococcusaureuswere 3.05 cm and 3.26 cm, respectively. The optimum medium combination was: NaNO3, Tryptone, Glucose, and (NH4)2SO4were 0.6 g, 2 g, 25 g and 1.5 g, respectively.

lily; endophytes; identification

R284.1

A

1009-9735(2017)05-0010-04

2017-03-27

安徽高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2017A403)；安徽高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(KJ2016SD61)；皖西學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目(wxxy2017110，2016wxxy35，2016wxxy64)；皖西學(xué)院省級大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(AH201510376027)聯(lián)合資助。

孫傳伯(1978-)，男，安徽桐城人，碩士，講師，研究方向：微生物工程；通信作者：韓邦興(1978-)，男，安徽樅陽人，博士，教授，研究方向：中藥學(xué)。