肖春霞，文永盛，周世玉（成都市食品藥品檢驗研究院，成都610045）

HPLC法同時測定參柏舒心顆粒中4種成分的含量Δ

肖春霞＊，文永盛#，周世玉（成都市食品藥品檢驗研究院，成都610045）

目的：建立同時測定參柏舒心顆粒中丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和鹽酸黃柏堿含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters sunfire-C18，流動相為乙腈-0.05%三氟乙酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為288 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果：丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和鹽酸黃柏堿檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.040 01～1.600 46 μg（r＝0.999 9）、0.013 84～0.553 7 μg（r＝0.999 9）、0.049 32～1.972 94 μg（r＝0.999 6）、0.014 46～0.578 6 μg（r＝0.999 8）；定量限分別為7.68、2.66、4.74、1.38 ng，檢測限分別為1.92、0.66、2.36、0.69 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2%；加樣回收率分別為98.846%～100.762%（RSD＝0.77%，n＝6）、96.632%～99.463%（RSD＝0.98%，n＝6）、98.541%～100.432%（RSD＝0.82%，n＝6）、98.607%～101.521%（RSD＝1.11%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，可用于參柏舒心顆粒中4種成分含量的同時測定。

參柏舒心顆粒；含量測定；丹參素鈉；原兒茶醛；丹酚酸B；鹽酸黃柏堿；高效液相色譜法

參柏舒心顆粒由丹參、北沙參、黃柏、牡蠣、龍骨五味中藥組成，具有活血祛瘀、養(yǎng)陰益氣、定悸除煩的功效，臨床用于心悸、怔仲、心煩失眠等的治療[1]。參柏舒心顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第7冊）》，名為舒心沖劑，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有2個理化鑒別指標(biāo)，難以有效地控制其質(zhì)量。丹參為方中君藥，其主要有效成分為丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B[2-4]；黃柏為方中臣藥，主要有效成分為生物堿類，其中鹽酸黃柏堿是黃柏生物堿類的專屬性成分[5-7]。目前尚未有同時測定上述4種成分含量的報道，且又鑒于提高《中國藥典》藥品標(biāo)準(zhǔn)的目的，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定參柏舒心顆粒中丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和鹽酸黃柏堿含量的方法，并對目前市場上流通的10批參柏舒心顆粒進(jìn)行含量測定，以期為完善其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 infinity型HPLC儀，包括G1315D1260二極管陣列檢測器、G1329B1260自動進(jìn)樣器、Agilent OpenLAB色譜工作站（美國Agilent公司）；AE-240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AUX-220型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；SK250H型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

參柏舒心顆粒（云南騰藥制藥有限公司，批號：160101、160102、160103；云南銘鼎制藥有限公司，批號：141032、150770、151210；修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：161001、160901、160902、160703，規(guī)格均為14 g/袋）；丹參素鈉對照品（批號：110855-201210，純度：91.2%）、原兒茶醛對照品（批號：110810-201007，純度：98.2%）、丹酚酸B對照品（批號：111562-201514，純度：93.7%）、鹽酸黃柏堿對照品（批號：111895-201504，純度：94.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters sunfire-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%三氟乙酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：288 nm[8]；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。?

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和鹽酸黃柏堿對照品各適量，加70%甲醇溶液制成每1 mL含丹參素鈉320.09 μg、原兒茶醛110.74 μg、丹酚酸B 394.59 μg和鹽酸黃柏堿115.72 μg的混合對照品貯備液；精密量取上述混合對照品貯備液3 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液取樣品研細(xì)，取5 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加70%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz，下同）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液取處方中除丹參、黃柏外的其余藥味制成不含丹參、黃柏的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以丹酚酸B峰計均＞100 000，其保留時間為96.5 min，陰性對照溶液在相應(yīng)保留時間處無色譜峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液10、5、2.5、1.25、0.5、0.25 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液5μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD，結(jié)果見表3。

表3 LOQ與LOD測定結(jié)果（ng）Tab 3 Results of LOQ and LOD（ng）

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、鹽酸黃柏堿峰面積的RSD分別為0.68%、1.13%、1.12%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160901）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、鹽酸黃柏堿峰面積的RSD分別為0.47%、1.52%、0.93%、0.55%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號：160901）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、鹽酸黃柏堿的含量平均值分別為0.911、0.123、1.090、0.129 mg/g，RSD分別為1.74%、1.58%、1.27%、0.88%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：160901）共6份，每份約2.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/袋）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/bag）

3 討論

3.1 流動相的選擇

試驗中曾比較了多個流動相系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%三氟乙酸溶液[8-12]）對色譜分離的影響。結(jié)果，乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時能使丹參中3種成分均達(dá)到較理想的分離效果，但對鹽酸黃柏堿的測定有干擾；以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，4種待測成分均能得到良好的分離，且具有重復(fù)性好、柱效高等特點。因此，選擇乙腈-0.05%三氯乙酸溶液（梯度洗脫）為本試驗的流動相。

3.2 檢測波長的選擇

本研究采用二級管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)分別對丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和鹽酸黃柏堿進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示丹酚酸B在288 nm波長處有最大吸收，丹參素鈉、原兒茶醛和鹽酸黃柏堿在此波長處亦有較大的吸收。因此，選擇288 nm為本試驗的檢測波長。

3.3 提取溶劑的考察

本試驗曾考察了2%鹽酸溶液、70%甲醇溶液、1%鹽酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）等多個溶劑系統(tǒng)[11-13]對樣品的提取效果。結(jié)果，2%鹽酸溶液作為提取溶劑時，不能將丹酚酸B提取出來；1%鹽酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）作為提取溶劑時，制備的供試品溶液中丹參素鈉和丹酚酸B極不穩(wěn)定；而以70%甲醇溶液作為提取溶劑時，待測成分的提取率及供試品溶液的穩(wěn)定性均較好。因此，本試驗選擇70%甲醇溶液為提取溶劑。

3.4 樣品含量測定結(jié)果分析

從10批樣品的含量測定結(jié)果來看，4種成分含量差異很大。為進(jìn)一步考察樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B以及鹽酸黃柏堿的真實含量，本課題組曾采取不同的條件制備4份浸膏進(jìn)行含量測定。結(jié)果，不同的提取條件和干燥方法對樣品中鹽酸黃柏堿的含量影響不大，而對樣品中3種水溶性成分的含量比例影響很大。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，丹參的水溶性成分在一定條件下會互相轉(zhuǎn)化[14]。故本試驗樣品中丹參重要有效成分的含量測定以3種成分的總量進(jìn)行計算。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，可用于參柏舒心顆粒中4種成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Shenbai Shuxin Granules by HPLC

XIAO Chunxia，WEN Yongsheng，ZHOU Shiyu（Chengdu Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of sodium danshensu，protocatechuic aldehyde，salvianolic acid B and phellodendrine hydrochloride in Shenbai shuxin granules.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Waters sunfire-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%trifluoroacetic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 288 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 5 μL.RESULTS：The linear ranges of sodium danshensu，protocatechuic aldehyde，salvianolic acid B and phellodendrine hydrochloride were 0.040 01-1.600 46 μg（r＝0.999 9），0.013 84-0.553 7 μg（r＝0.999 9），0.049 32-1.972 94 μg（r＝0.999 6），0.014 46-0.578 6 μg（r＝0.999 8）.The limits of quantitation were 7.68，2.66，4.74，1.38 ng，and the limits of detection were 1.92，0.66，2.36，0.69 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2%.The recoveries were 98.846%-100.762%（RSD＝0.77%，n＝6），96.632%-99.463%（RSD＝0.98%，n＝6），98.541%-100.432%（RSD＝0.82%，n＝6），98.607%-101.521%（RSD＝1.11%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and precise.It can be used for 4 components in Shenbai shuxin granules.

Shenbai shuxin granules；Content determination；Sodium danshensu；Protocatechuic aldehyde；Salvianolic acid B；Phellodendrine hydrochloride；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2017）30-4265-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.23

國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高研究課題（No.財社〔2015〕77號）

＊主管藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：028-85362592。E-mail：79598093@qq.com

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：028-85362592。E-mail：cdwyscd@163.com

2017-05-09

2017-07-15）

（編輯：劉柳）