張振華，鐘蘋蘋，徐英（1.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海01401；.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海0103；3.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海0103）

HPLC法同時(shí)測(cè)定痰熱清膠囊中7種成分的含量Δ

張振華1＊，鐘蘋蘋2，徐英1，3#（1.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海201401；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203；3.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海201203）

目的：建立同時(shí)測(cè)定痰熱清膠囊中7種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Ultimate XB C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C和黃芩苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.025～0.5 μg（r＝0.999 6）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 7）、0.050～1.0 μg（r＝0.999 9）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 7）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 6）、0.025～0.5 μg（r＝0.999 6）和0.750～1.5 μg（r＝0.999 9）；定量限均≤1.5 ng，檢測(cè)限均為0.5 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率為95.28%～106.30%（RSD為0.97%～2.14%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于痰熱清膠囊中7種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

痰熱清膠囊；綠原酸；異連翹酯苷A；連翹酯苷A；異綠原酸；黃芩苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

和漢黃芩苷等黃酮類成分[4-8]，?；切苋パ跄懰岷托苋パ跄懰岬饶懼犷惓煞諿9-11]，氨基酸、有機(jī)酸、苯乙醇苷類和木脂素類成分等[12-17]。該制劑現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分為黃芩苷和熊去氧膽酸，尚無針對(duì)其他化學(xué)成分的分析和報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定痰熱清膠囊中綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C和黃芩苷7種成分含量，以為更好地控制該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括在線脫氣裝置、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Agilent化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；BT25S型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Vortex Mixer型渦旋儀（美國(guó)Labnet公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

痰熱清膠囊（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1406101、1407101、1407102，規(guī)格：0.4 g/粒）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：140601）、異連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)：Y-184-140801）、連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)：L-012-140730）、異綠原酸B對(duì)照品（批號(hào)：Y-069-141122-1）、異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)：140615）、異綠原酸C對(duì)照品（批號(hào)：Y-070-140801）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：150517）均購自上海欣拓貿(mào)易有限公司，純度均≥98%；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～20 min，10%→13%A；20～25 min，13%→18%A；25～50 min，18%A；50～55 min，18%→25%A；55～60 min，25%→85%A；60～70 min，85%→90%A；70～80 min，90%A）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液取待測(cè)成分對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷質(zhì)量濃度分別為50、50、100、50、50、50、1 500 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，混勻，取約25 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理15 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液按痰熱清膠囊處方和工藝制備缺黃芩、金銀花和連翹的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)為30 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測(cè)限（n＝6）Tab 1 Regression equations，linear ranges，quantitation limits and detection limits（n＝6）

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限，詳見表1。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.78%、1.27%、1.83%、1.76%、1.92%、1.03%、0.53%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1406101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.19%、1.09%、1.69%、0.93%、1.35%、1.81%、1.16%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：1406101）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷含量的平均值分別為0.40%、0.47%、0.99%、0.33%、0.22%、0.40%、19.20%，RSD分別為2.35%、1.63%、1.75%、2.04%、2.51%、1.83%、1.38%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：1406101）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表2Continued Tab 2

分別取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察

3.1.1 提取溶劑的選擇筆者分別考察了甲醇、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液和水4種不同提取溶劑對(duì)痰熱清膠囊提取效果的影響。結(jié)果表明，70%甲醇溶液對(duì)異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的提取效果最好，水對(duì)綠原酸的提取效果最好，甲醇對(duì)黃芩苷的提取效果最好。鑒于痰熱清膠囊中7種成分含量最高的是黃芩苷，同時(shí)考慮到制備方法的簡(jiǎn)便性，本試驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

3.1.2 提取時(shí)間的選擇筆者分別考察了5、10、15、20、25、30 min 6種不同提取時(shí)間對(duì)痰熱清膠囊提取效果的影響。結(jié)果表明，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷含量均隨著提取時(shí)間的增加，呈先增后減的趨勢(shì)。超聲提取時(shí)間過長(zhǎng)或過短均不利于樣品中7種成分的提取，而且當(dāng)提取時(shí)間為15 min時(shí)7種成分的整體提取效果最佳。因此，超聲提取時(shí)間選定為15 min。

3.1.3 溶劑量的考察預(yù)試驗(yàn)中，筆者取樣品內(nèi)容物的粉末約25 mg，精密稱定，置于不同規(guī)格的量瓶中，分別加入5、10、25 mL的甲醇，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分的峰面積。結(jié)果表明，提取溶劑為5 mL時(shí)7種成分的峰面積分別為提取溶劑為10、25 mL時(shí)的峰面積的2、5倍，同時(shí)考慮節(jié)省溶劑并綠色環(huán)保的原則，選擇提取溶劑甲醇的量為5 mL。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇筆者分別考察了280、290、300、310、325、330、340 nm 7種不同波長(zhǎng)下7種成分的吸光度。結(jié)果，隨著檢測(cè)波長(zhǎng)的增加，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的吸光度均呈先增后減的趨勢(shì)，而黃芩苷則呈遞減的趨勢(shì)，鑒于黃芩苷在痰熱清膠囊中含量較高，為了提高低含量成分的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，宜選擇較大的波長(zhǎng)。經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)波長(zhǎng)為325 nm時(shí)，綠原酸、異連翹酯苷A、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的吸光度最大，能較好地反映出樣品中7種成分的整體含量。因此，選擇325 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2.2 色譜柱的選擇筆者分別考察了3種不同色譜柱Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)供試品溶液的分離效果。結(jié)果表明，Ultimate XB C18色譜柱分離效果優(yōu)于其他兩種色譜柱。因此，選擇Ultimate XB C18為分析色譜柱。

3.2.3 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇筆者分別考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.3%甲酸溶液（梯度洗脫）3種不同流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)供試品溶液的分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，峰形較好，保留時(shí)間適中，基線較平穩(wěn)。因此，選擇乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫）作為分析流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.2.4 柱溫的選擇筆者分別考察了25、30、35、40℃4種不同柱溫對(duì)供試品溶液的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為35℃時(shí)，7種成分分布較均勻，整體分離度最好，基線比較平穩(wěn)。因此，柱溫選定為35℃。

3.2.5 流速的選擇筆者分別考察了0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min 4種不同流速對(duì)供試品溶液的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，7種成分整體分離度最好。因此，流速選擇為0.8 mL/min。

3.3 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

3批樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，7種成分中黃芩苷含量最高，分別為19.20%、19.09%、18.58%，均符合現(xiàn)有痰熱清膠囊國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中“本品每粒（0.4 g/粒）含黃芩以黃芩苷計(jì)，不得少于60 mg”（即黃芩苷含量不得少于15%）的規(guī)定；且3批樣品黃芩苷含量的RSD為1.75%，說明黃芩苷含量的批間差異較小。

3批樣品中來自金銀花的綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均含量分別為0.40%、0.34%、0.24%、0.41%，共計(jì)1.39%；來自連翹的異連翹酯苷A、連翹酯苷A的平均含量分別為0.55%、1.13%，共計(jì)1.68%。鑒于這6種成分的含量均較低，含量測(cè)定結(jié)果誤差較大，因此在建立痰熱清膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定部分時(shí)，可以考慮以金銀花中有機(jī)酸類成分總量、連翹中苯乙醇苷類成分總量作為含量測(cè)定指標(biāo)。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于痰熱清膠囊中7種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 鐘蘋蘋，劉紹勇，張小利，等.痰熱清膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].江蘇科技信息，2016（20）：37-40.

[2] 張黎莉，李展，徐曉月，等.痰熱清膠囊的主要藥效學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2004，10（3）：37-40.

[3] 張廣偉，宋慶宏，杜學(xué)航，等.不同處方工藝的痰熱清膠囊解熱、祛痰作用比較[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19（14）：23-25.

[4] Qiao X，Li R，Song W，et al.A targeted strategy to analyze untargeted mass spectral data：rapid chemical profiling of Scutellaria baicalensis using ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole orbitrap mass spectrometry and key ion filtering[J].J Chromatogr A，2016，1223（4）：83-95.

[5] Liu G，Ma J，Chen Y，et al.Investigation of flavonoid profile of Scutellaria bacalensis Georgi by high performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ion trap mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2009，1216（23）：4809-4814.

[6] 孟慶剛，王微，李強(qiáng)，等.黃芩解熱作用的譜效關(guān)系研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（6）：379-383.

[7] 辛文妤，宋俊科，何國(guó)榮，等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2013，22（6）：647-659.

[8] 趙梅，周淑琴.黃芩中黃酮類化合物抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2013，24（11）：1050-1052.

[9] Qiao X，Ye M，Pan D，et al.Differentiation of various traditional Chinese medicines derived from animal bile and gallstone：simultaneous determination of bile acids by liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2011，1218（1）：107-117.

[10] 王佳婧，鄭勇鳳，秦晶，等.熊膽粉的藥理作用與新劑型研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（7）：598-602.

[11] 周超凡，高國(guó)建，劉穎.熊膽粉研究進(jìn)展述評(píng)[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（7）：1252-1258.

[12] 劉紹勇，薛東升，李江海，等.山羊角提取物中氨基酸的種類研究與含量測(cè)定[J].中南藥學(xué)，2014，12（3）：271-274.

[13] 楊清林，傅亞.山羊角提取物中氨基酸含量測(cè)定研究[J].中藥材，2011，34（7）：1023-1026.

[14] 李小芩，孫曉紅，蔡爽，等.采用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚類分析研究不同品種金銀花的化學(xué)成分及其差異[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（8）：895-904.

[15] 雷玲，李興平，白筱璐，等.金銀花抗內(nèi)毒素、解熱、抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床，2012，28（1）：115-117.

[16] Cui Y，Wang Q，Shi X，et al.Simultaneous quantification of 14 bioactive constituents in Forsythia Suspensa by liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry[J].Phytochem Anal，2010，21（3）：253-260.

[17] 孟祥樂，李俊平，李丹，等.連翹的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2010，21（43）：4117-4119.

Simultaneous Determination of 7 Components in Tanreqing Capsules by HPLC

ZHANG Zhenhua1，ZHONG Pingping2，XU Ying1，3（1.Shanghai Kaibao Parmaceutical Co.，Ltd.，Shanghai 201401，China；2.College of TCM，Shanghai University of TCM，Shanghai 201203，China；3.Shanghai Research Center for TCM Standardization，Shanghai 201203，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of 7 components in Tanreqing capsules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%formic acid（gradient elution）at a flow rate of 0.8 mL/min.The detection wavelength was set at 325 nm，and column temperature was 35℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of chlorogenic acid，isoforsythiaside A，forsythiaside A，isochlorogenic acid B，isochlorogenic acid A，isochlorogenic acid C and baicalin were 0.025-0.5 μg（r＝0.999 6），0.025-0.5 μg（r＝0.999 7），0.050-1.0 μg（r＝0.999 9），0.025-0.5 μg（（r＝0.999 7），0.025-0.5 μg（（r＝0.999 6），0.025-0.5 μg（r＝0.999 6），0.750-1.5 μg（r＝0.999 9），respectively.The limit of quantitation was no more than 1.5 ng，and the limit of detection was 0.5 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 95.28%-106.30%（RSD ranged 0.97%-2.14%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 7 components in Tanreqing capsules.

Tanreqing capsules；Chlorogenic acid；Isoforsythiaside A；Forsythiaside A；Isochlorogenic acid；Baicalin；HPLC；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2017）30-4256-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.21

痰熱清膠囊是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹等5味中藥材組合而成的中藥復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)清熱、化痰解毒的功效[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，痰熱清膠囊的主要成分包括黃芩苷

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81403089）

＊質(zhì)量工程師。研究方向：中藥質(zhì)量控制。E-mail：kbzzh@sina.com

#通信作者：助理研究員，博士。研究方向：藥物分析及新藥研發(fā)。E-mail：skyxu_1983@163.com

2016-11-18

2017-01-16）

（編輯：張靜）