李真，周立紅，楊功俊，葉正良（.中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京0009；.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，天津30040；3.天士力控股集團(tuán)有限公司，天津30040）

·藥物分析與檢定·

近紅外漫反射光譜法快速測(cè)定丹參藥材中多指標(biāo)成分的含量Δ

李真1＊，周立紅2，楊功俊1，葉正良3#（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京210009；2.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，天津300410；3.天士力控股集團(tuán)有限公司，天津300410）

目的：建立快速測(cè)定丹參藥材中多指標(biāo)成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分（丹參酮ⅡA+丹參酮Ⅰ+隱丹參酮）的含量（作為參考值）。采用偏最小二乘法-近紅外漫反射光譜法建立預(yù)測(cè)丹參藥材中上述指標(biāo)成分含量的定量模型：根據(jù)參考值，采集143批樣品，以一階導(dǎo)數(shù)法預(yù)處理光譜，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分的最佳波段分別為6 773.98～3 981.12、6 670.85～3 996.54、8 544.66～3 936.28、8 188.06～3 875.31 cm－1。結(jié)果：丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹參酮類成分含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證符合要求。丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分的定量校正模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.919 0、0.832 2、0.821 5、0.925 6，校正均方差分別為4.46、0.48、1.34、0.71；外部驗(yàn)證R2分別為0.852 6、0.957 3、0.819 3、0.953 1，均方差分別為9.77、0.28、0.94、0.63。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、無(wú)污染，可用于丹參藥材中多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定。

近紅外漫反射光譜法；丹參；酚酸；丹參酮；快速測(cè)定；含量

中藥材在采購(gòu)、驗(yàn)收、入庫(kù)、投料過(guò)程中存在著質(zhì)量檢測(cè)繁雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，不能滿足大批量的現(xiàn)場(chǎng)快速分析要求[1]。為解決該問(wèn)題，有必要研發(fā)涵蓋水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、指標(biāo)成分等不同檢測(cè)項(xiàng)目的快速檢測(cè)方法作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，與法定標(biāo)準(zhǔn)一起構(gòu)建準(zhǔn)確、便捷、普適性強(qiáng)的中藥材整體質(zhì)量快速評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以保障最終制劑產(chǎn)品質(zhì)量的可控。

近紅外漫反射光譜法（NIR）作為一種快速分析方法，具有很多優(yōu)點(diǎn)：快速，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)和在線分析；無(wú)損；環(huán)保；可對(duì)固體、液體和氣體樣品直接進(jìn)行測(cè)定，無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程[2-6]。隨著儀器與軟件的發(fā)展，NIR法己廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、石油化工等領(lǐng)域[7-8]。

丹參藥材為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，化學(xué)成分以丹參酮和酚酸類化合物為主[9]，具有改善模型動(dòng)物腦缺血再灌注損傷、血液流變學(xué)及血小板功能等方面的作用[10]，是復(fù)方丹參滴丸成方制劑中一味主要的原藥材[11]。本研究中，筆者以丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分（丹參酮ⅡA+丹參酮Ⅰ+隱丹參酮）為指標(biāo)成分，應(yīng)用NIR技術(shù)，并結(jié)合偏最小二乘法（PLS），建立了快速通用的多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，為構(gòu)建基于NIR技術(shù)的中藥材整體質(zhì)量快速評(píng)價(jià)方法體系提供了一種新的思路。

1 材料

1.1 儀器

AntarisⅡ型傅里葉變換NIR儀，包括漫反射積分球附件、樣品旋轉(zhuǎn)臺(tái)及石英樣品杯、InGaAs檢測(cè)器、Result軟件、TQ Analyst 8.0軟件[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；2695型高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；高速中藥粉碎機(jī)（山東省青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK1200B型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)：110766-200619，純度：＞98.0%）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-201102，純度：＞99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；紫草酸對(duì)照品（天津士蘭科技有限公司，批號(hào)：20130908，純度：＞98.0%）；丹酚酸B對(duì)照品（天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：2013061，純度：＞93.06%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

143批丹參藥材來(lái)源于陜西、山西、四川、甘肅、河南、河北等省，由天士力制藥集團(tuán)股份有限公司提供，經(jīng)浙江理工大學(xué)梁宗鎖教授鑒定均為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 NIR的采集

采樣方式：積分球固體采樣。采集條件：分辨率為8 cm－1，掃描范圍為12 000～3 800 cm－1，掃描64次，每批藥材樣品采集6張光譜，計(jì)算平均光譜以建立模型，每次掃描前振蕩樣品杯。藥材樣品的裝樣厚度、裝填的緊密性和顆粒均勻性等在試驗(yàn)中都力求一致，以減小對(duì)結(jié)果的影響。143批藥材樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

圖1 143批藥材樣品的近紅外光譜疊加圖Fig 1 Superposed NIR spectrum of 143 batches of samples

2.2 參考值的測(cè)定

2.2.1 丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸的含量測(cè)定（1）色譜條件。色譜柱：Diamonsil Plus C1（8250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（22∶78，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL[12]。色譜見圖2。（2）混合對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品各適量，加75%甲醇溶液制成丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸質(zhì)量濃度分別為0.504、0.076、0.201 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密量取上述單一對(duì)照品溶液各適量，加75%甲醇溶液制成丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸質(zhì)量濃度分別為100.848、10.660、8.042 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。取藥材樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：140 W，頻率：42 kHz，下同）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（4）方法學(xué)考察。按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸峰面積的RSD均＜2.0%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。（5）藥材樣品含量測(cè)定。取143批藥材樣品各適量，分別按“（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量。結(jié)果，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸含量分別為1.03～78.24、0.33～5.21、0.24～4.22 mg/g。

圖2 丹酚酸B、迷迭香酸和紫草酸的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of salvianolic acid B，rosmarinic acid and lithospermic acid

2.2.2 丹參酮類成分的含量測(cè)定（1）色譜條件。色譜柱：Diamonsil C1（8200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.02%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，61%A；6～20 min，61%→90%A；20～20.5 min，90%→61%A；20.5～25 min，61%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL。色譜見圖3。（2）對(duì)照品溶液的制備。取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度為20μg/mL的對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。按“2.2.1（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。（4）方法學(xué)考察。按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中丹參酮ⅡA峰面積的RSD均＜1.3%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。（5）藥材樣品含量測(cè)定。取143批藥材樣品各適量，分別按“2.2.1（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量。結(jié)果，丹參酮類成分含量分別為0.887～10.913 mg/g。

A.對(duì)照品；B.供試品；1.丹參酮ⅡAA.substance control；B.test sample；1.tanshinoneⅡA

2.3 NIR定量校正模型的建立與驗(yàn)證

2.3.1 校正集和驗(yàn)證集樣品的選擇根據(jù)“2.2”項(xiàng)下丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸和丹參酮類成分含量分布情況，從143批藥材樣品中選取一定數(shù)量組成校正集，用于建立NIR模型；其余藥材樣品組成驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型，詳見表1。

表1 校正集與驗(yàn)證集樣品指標(biāo)成分含量分布范圍Tab 1 Content distribution of index component of sample in calibration and validation set

2.3.2 光譜預(yù)處理方法的選擇NIR的采集容易受顏色、藥材樣品顆粒大小等影響，以致基線漂移和平移，因此必須對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法（Multiple scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（Standard normal variate，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)法（First derivative，F(xiàn)D）、二階導(dǎo)數(shù)法（Second derivative，SD）[13]，通過(guò)采用不同預(yù)處理方法可得不同的校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（R2）和內(nèi)部交叉驗(yàn)證校正均方差（RMSECV），詳見表2。

運(yùn)用TQ Analyst 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合PLS法建立近紅外定量分析模型。選擇R2、RMSECV為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同模型的準(zhǔn)確性與適用性。其中，R2越接近1，NIR預(yù)測(cè)值與參考值相關(guān)性越好；RMSECV越小，所建定量分析模型適用性越強(qiáng)，預(yù)測(cè)效果越好。結(jié)果表明，以1st D法預(yù)處理效果最好，可以消除多重光譜偏差；對(duì)導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行微調(diào)處理，經(jīng)最佳光譜預(yù)處理方法處理后得近紅外光譜，詳見圖4。

表2 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)定量模型性能的影響Tab 2 Effects of different pretreatment methods on quantitative model performance

圖4 預(yù)處理后的近紅外光譜Fig 4 NIR spectra after pretreatment

2.3.3 建模波段的選擇建模波段要求在包含藥材樣品的大量信息的同時(shí)避免冗余信息，降低噪聲干擾[14]。采用FD法對(duì)不同的波段范圍進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化比較，通過(guò)TQ Analyst 8.0軟件分析得丹酚酸B最佳波段為6 773.98～3 981.12 cm－1，迷迭香酸最佳波段為6 670.85～3 996.54 cm－1，紫草酸最佳波段為8 544.66～3 936.28 cm－1，丹參酮類成分最佳波段為8 188.06～3 875.31 cm－1，詳見表3。

表3 不同波段對(duì)R2和RMSECV的影響Tab 3 Effects of different spectral ranges on R2and RMSECV

2.3.4 主成分?jǐn)?shù)的選擇在建模過(guò)程中，采用不同的主成分?jǐn)?shù)，模型的預(yù)測(cè)能力不同：主成分?jǐn)?shù)太少，建模信息不全，預(yù)測(cè)能力太低；反之，主成分?jǐn)?shù)太多，驗(yàn)證過(guò)程會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象[5]。采用留一交叉驗(yàn)證法考察主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV的影響，并作曲線，詳見圖5。結(jié)果表明，定量校正模型主成分?jǐn)?shù)分別為13、10、11、17時(shí)，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分模型的RMSECV最小。

2.3.5 定量模型的建立運(yùn)用TQ Analyst 8.0軟件，對(duì)143批藥材樣品進(jìn)行建模，對(duì)光譜采用FD預(yù)處理方法，在“2.3.3”項(xiàng)下波段內(nèi)對(duì)4個(gè)主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行建模。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)性較高，且結(jié)果很接近，該模型的性能較好，可以用于丹參藥材中多指標(biāo)成分的定量分析。定量模型校正集樣品內(nèi)部交叉驗(yàn)證見圖6。

2.3.6 定量模型的驗(yàn)證選擇樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證，將其近紅外圖譜輸入定量模型，預(yù)測(cè)各指標(biāo)成分含量，再與含量測(cè)定參考值進(jìn)行比較，結(jié)果見表4（表中“RMSEP”為外部驗(yàn)證均方差）；定量模型驗(yàn)證集樣品外部驗(yàn)證見圖7。

圖5 主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV的影響Fig 5 Effects of principal component fraction on RMSECV

圖6 定量模型校正集樣品內(nèi)部交叉驗(yàn)證Fig 6 Internal cross validation chart of quantitative model calibration set sample

3 討論

本試驗(yàn)建立了快速測(cè)定丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮類成分等指標(biāo)成分含量的NIR分析方法，選用各指標(biāo)成分的特征光譜區(qū)間，并根據(jù)不同分析對(duì)象優(yōu)選出合適的預(yù)處理方法，對(duì)NIR原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)而采用PLS法建立了各指標(biāo)成分含量的NIR定量模型。

在建模過(guò)程中，筆者最初采用單一指標(biāo)成分丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的含量建模，但由于單一指標(biāo)成分含量低于NIR的定量限，所建定量模型預(yù)測(cè)效果不佳。因此，最終選擇了它們的總含量（丹參酮ⅡA+丹參酮Ⅰ+隱丹參酮）建模，進(jìn)行含量預(yù)測(cè)，這也與2015年版《中國(guó)藥典》（一部）丹參項(xiàng)下丹參酮類成分含量的測(cè)定中規(guī)定以高效液相色譜法測(cè)定丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮總量進(jìn)行藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)[12]是一致的。

表4 定量模型驗(yàn)證結(jié)果Tab 4 Validation results of quantitative model

圖7 定量模型驗(yàn)證集樣品外部驗(yàn)證Fig 7 External validation chart of quantitative model validation set sample

NIR技術(shù)是間接分析技術(shù)，模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度直接受樣品實(shí)測(cè)值準(zhǔn)確度與采集光譜時(shí)外界條件的影響[13]。因此，采用高效液相色譜法對(duì)樣品各指標(biāo)成分含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，每批樣品需平行測(cè)定4份，測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)＜2%，以所測(cè)4次含量的平均值作為藥材樣品各指標(biāo)成分含量的參考值；采集光譜時(shí)，每份藥材樣品應(yīng)平行掃描6次，取平均光譜，以確保所建定量模型的準(zhǔn)確度。

本試驗(yàn)所采用的NIR分析方法速度快，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高，建立的定量模型可作為中藥材指標(biāo)成分含量分析的一般規(guī)律。雖然，NIR法的準(zhǔn)確度不及高效液相色譜法，但因其快速、無(wú)損、環(huán)保等特點(diǎn)，能滿足工業(yè)生產(chǎn)中大批量采集藥材樣品化學(xué)信息的需求，適用于快速測(cè)定中藥材高含量指標(biāo)成分，可與法定標(biāo)準(zhǔn)一起構(gòu)建準(zhǔn)確、便捷、普適性強(qiáng)的中藥材整體質(zhì)量快速評(píng)價(jià)方法體系，對(duì)保障最終制劑產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可控具有重要意義。

[1] 程躍.中藥制藥過(guò)程控制及集成化生產(chǎn)若干關(guān)鍵問(wèn)題研究[D].重慶：西南交通大學(xué)，2010.

[2] 胡詠川，田曉鑫，劉蕾，等.近紅外光譜技術(shù)鑒定中藥的進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（8）：1066-1071.

[3] Gombás á，Antal I，Szabó-Révész P，et al.Quantitative determination of crystallinity of alpha-lactose monohydrate by Near Infrared Spectroscopy（NIRS）[J].Int J Pharm，2003，256（1/2）：25-32.

[4] Otsuka，M.Chemoinformetrical evaluation of granule and tablet properties of pharmaceutical preparations by near-infrared spectroscopy[J].Chemom Intell Lab Syst，2006，82（1/2）：109-114.

[5] Otsuka，M.Comparative particle size determination of ph-enacetin bulk powder by using Kubelka-Munk theory and principal component regression analysis based on near-infrared spectroscopy[J].Powder Technol，2004，141（3）：244-250.

[6] Dévay A，Mayer K，Pál S，et al.Investigation on drug dissolution and particle characteristics of pellets related to manufacturing process variables of high-shear granulation[J].J Biochem Bioph Meth，2006，69（1/2）：197-205.

[7] 褚小立，陸婉珍.近五年我國(guó)近紅外光譜分析技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析，2014，34（10）：2595-2605.

[8] 孫素琴，周群，郁鑒源，等.分子振動(dòng)光譜法與中藥研究的最新進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析，2000，17（2）：199-202.

[9] 李巧玉，劉楊，包華音.近5年丹參化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2014，16（2）：145-146.

[10] 馬丙祥，董寵凱.丹參的藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2014，25（7）：663-665.

[11] 章弘揚(yáng)，胡坪，梁瓊麟，等.結(jié)合兩種LC/MS方法用于復(fù)方丹參滴丸中多成分的鑒定[J].中成藥，2009，31（1）：60-64.

[12] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：398.

[13] 耿姝.適宜中藥材體系的近紅外分析方法影響因素研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2016.

Rapid Determination of Multi-maker Ingredients in Salvia miltiorrhiza by Near Infrared Diffused Reflection Spectroscopy

LI Zhen1，ZHOU Lihong2，YANG Gongjun1，YE Zhengliang3（1.Dept.of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Tasly Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Tianjin 300410，China；3.Tasly Holding Group Co.，Ltd.，Tianjin 300410，China）

OBJECTIVE：To establish the method for rapid determination of nuezhenoside in Salvia miltiorrhiza.METHODS：The contents of salvianolic acid B，rosmarinic acid，lithospermic acid and tanshinone（tanshinoneⅡA+tanshinoneⅠ+cryptotanshinone）were determined by HPLC（as reference value）.Quantitative model for the contents of above components was established by partial least square（PLS）-NIR spectra.According to the reference value，143 samples were collected and the spectrum was pretreated by first-order derivative.The optimal range of wave band for salvianolic acid B，rosmarinic acid，oxalic acid and tanshinone were 6 773.98-3 981.12，6 670.85-3 996.54，8 544.66-3 936.28，8 188.06-3 875.31 cm－1.RESULTS：The methodology for the con-tent determination of salvianolic acid B，rosmarinic acid，oxalic acid and tanshinone were in line with the requirement.The coefficient（R2）of internal cross validation for quantitative correction model of salvianolic acid B，rosmarinic acid，oxalic acid and tanshinone were 0.919 0，0.832 2，0.821 5，0.925 6.The deviation of corrected mean square roots were 4.46，0.48，1.34，0.71，respectively.The R2values of external validation were 0.852 6，0.957 3，0.819 3，0.953 1，respectively；and mean square root of prediction error（RMSEP）were 9.77，0.28，0.94，0.63，respectively.CONCLUSIONS：The method is rapid，accurate，simple and pollution-free，and can be used for rapid determination of multi-maker ingredients in S.miltiorrhiza.

Near infrared diffuse reflectance spectroscopy；Salviae miltiorrhizae；Phenolic acids；Tanshinone；Rapid determination；Content

R284

A

1001-0408（2017）30-4247-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.21275162）

＊碩士研究生。研究方向：藥物現(xiàn)代儀器分析。E-mail：lz_fly_away@163.com

#通信作者：研究員。研究方向：藥物現(xiàn)代儀器分析。電話：022-86342066。E-mail：yezl@tasly.com

2016-11-22

2017-01-22）

（編輯：張靜）