趙凱亮 陳辰 石喬 趙亮 梅方超 王萍 王衛(wèi)星

糖原合酶激酶-3β在急性壞死性胰腺炎腎損傷中的表達及作用機制

趙凱亮 陳辰 石喬 趙亮 梅方超 王萍 王衛(wèi)星

目的觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腎臟的組織形態(tài)及超微結構變化，檢測ANP大鼠腎臟組織糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)及磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的蛋白表達。方法60只雄性SD大鼠隨機分為對照組及ANP 3、6、12、24 h組，每組12只。采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c溶液制備大鼠ANP模型。在相應時間點處死大鼠后取血及胰腺和左腎組織，檢測血淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮水平，常規(guī)行胰腺和腎臟組織病理學檢查，透射電鏡下觀察大鼠腎超微結構改變，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測腎臟組織GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達。結果ANP大鼠血淀粉酶、脂肪酶、肌酐、尿素氮水平以及胰腺及腎組織的病理評分均較對照組顯著升高，且隨著時間延長逐漸升高。ANP大鼠腎小管上皮細胞表面微絨毛腫脹、排列紊亂，胞核固縮、碎裂，核內(nèi)見染色質(zhì)濃縮、核膜分離，胞質(zhì)內(nèi)線粒體凝集、腫脹，空泡樣變。對照組及ANP 3、6、12、24 h組大鼠腎組織GSK-3β蛋白表達量分別為0.702±0.044、0.876±0.017、0.872±0.034、0.855±0.035、0.852±0.032；p-GSK-3β表達量為0.626±0.029、0.790±0.029、0.616±0.021、0.448±0.028、0.439±0.017。ANP各時點組腎組織GSK-3β蛋白表達均較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，但ANP各時點組間的差異均無統(tǒng)計學意義。p-GSK-3β表達在造模后3 h升高，以后逐漸下降，其中ANP 3 h組顯著高于對照組及ANP其他時點組，ANP 12、24 h組顯著低于對照組及ANP 3、6 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。結論ANP大鼠腎臟GSK-3β表達在造模3 h即升高，并維持在較高水平，p-GSK-3β在造模3 h時一過性升高，以后逐漸下降，并降至顯著低于對照組，這一變化在ANP并發(fā)腎損傷的過程中可能發(fā)揮重要作用。

胰腺炎，急性壞死性； 急性腎功能不全； 糖原合酶激酶-3β

Fundprogram：National Natural Science Foundation of China(81370562)；Fundamental Research Funds for the Central Universities(2042015kf0086)

重癥急性胰腺炎(SAP)并發(fā)腎功能損傷的概率僅次于肺損傷，嚴重者可進展為急性腎功能衰竭，病死率可高達80%[1-2]。大量研究表明，微循環(huán)障礙、體內(nèi)產(chǎn)生的大量炎性介質(zhì)、細胞因子及細胞凋亡等因素在SAP并發(fā)腎損傷的發(fā)病機制中起著重要的作用，但其具體機制仍不十分清楚。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是存在于真核細胞內(nèi)的一種多功能蛋白激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。GSK-3β不僅通過激活糖原合成酶調(diào)節(jié)細胞糖代謝從而調(diào)控細胞能量代謝過程，而且在炎癥相關疾病的細胞壞死和器官衰竭中發(fā)揮重要作用[3-4]。但GSK-3β是否參與SAP并發(fā)的腎損傷尚未見相關報道。本研究建立急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)腎損傷的大鼠模型，檢測腎組織GSK-3β蛋白表達及其磷酸化狀態(tài)(p-GSK-3β)的變化趨勢，探討其在ANP相關性腎損傷發(fā)病中的可能作用。

材料與方法

一、實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠60只，體重150～200 g，由湖北省疾病預防控制中心提供。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組及ANP 3、6、12、24 h組，每組12只。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。采用主胰管逆向注射5%?；悄懰徕c溶液1 ml/kg體重(Sigma公司)的方法制備ANP模型。對照組胰膽管內(nèi)注入等容積生理鹽水。對照組術后12 h、ANP組按各時間點分批處死大鼠。下腔靜脈穿刺采血，離心分離血清，置-20℃保存?zhèn)溆茫蝗〔糠忠认俳M織和左側腎臟組織置4%多聚甲醛液固定，部分左側腎臟組織置2%戊二醛液固定，其余腎臟組織立即經(jīng)液氮凍存后置-80℃冰箱保存。

二、方法

1．胰腺、腎臟組織病理學檢查：取4%多聚甲醛固定的胰腺、腎臟組織，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。分別參照Schmidt等[5]、Paller等[6]標準對胰腺及腎臟組織進行病理評分。

2．腎臟組織超微結構觀察：取1 mm×1 mm×1 mm 2%戊二醛磷酸鈉固定的腎臟組織塊制成超薄切片，置日立H-300型透射電鏡下觀察腎臟超微結構變化并拍照。

3．血淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮水平檢測：委托武漢大學人民醫(yī)院檢驗中心進行檢測。

4．腎臟組織GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達檢測：取凍存的腎臟組織，應用蛋白裂解液制備勻漿，置冰上孵育30 min，4℃ 13 000 r/min離心30 min，取上清液。應用BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白行蛋白質(zhì)印跡法檢測GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達。兔抗大鼠GSK-3β、p-GSK-3β及內(nèi)參β-actin多克隆抗體均購自Cell Signalling Technology公司，工作濃度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000，辣根過氧化酶標記二抗工作濃度為1∶3 000。最后ECL化學發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。采用Image-ProPlus蛋白灰度分析軟件掃描檢測蛋白質(zhì)條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量，并計算p-GSK-3β/GSK-3β比值。實驗重復3次，取均值。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、血淀粉酶、脂肪酶、肌酐、尿素氮水平變化

造模后3 h大鼠血清淀粉酶、脂肪酶活性及肌酐、尿素氮水平即升高，并隨病程進展而逐漸增加，分別于24 h、24 h、24 h及12 h達峰值，ANP各時間點的水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。ANP 12 h組與24 h組間比較差異無統(tǒng)計學意義，其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1)。

二、各組大鼠胰腺及腎臟組織病理學改變

對照組胰腺組織無明顯病理改變。ANP組各時點胰腺組織呈現(xiàn)不同程度充血、水腫、出血、壞死、炎性細胞浸潤和胰周脂肪壞死，隨時間進展，胰腺壞死程度加重、范圍明顯擴大，12 h和24 h時可見大片狀壞死、腺體結構破壞嚴重(圖1上)。ANP各時點組病理評分均較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，且ANP各時點組間的差異也均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表2)。

對照組大鼠腎臟組織無明顯病理改變。ANP 3 h組見腎小管上皮細胞水腫，間質(zhì)血管輕度充血，無出血改變；6 h組見部分腎小球瘀血，腎小管管壁明顯充血、水腫，少量腎小管上皮細胞壞死，向管腔脫落，間質(zhì)可見少量紅細胞及炎細胞浸潤；12 h組見腎小球淤血性改變，細胞界限模糊，腎小管上皮細胞壞死脫落，管腔內(nèi)可見大量管型形成，腎小管管腔變窄或閉塞，大量炎癥細胞浸潤；24 h組見大片腎小球缺血、壞死，腎小管大量管型形成，大量上皮細胞壞死(圖1下)。ANP各時點組病理評分均較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。除12與24 h組之外，其他ANP各時點組間的差異也均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表2)。

三、腎臟組織超微結構改變

對照組大鼠腎臟組織腎小管上皮細胞微絨毛結構排列整齊，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布較均勻，無核膜分離現(xiàn)象，線粒體大小及排列均勻一致，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，無擴張；ANP 12 h組大鼠腎臟的腎小管上皮細胞表面微絨毛腫脹、減少，排列紊亂，微絨毛末端呈桿狀膨大，細胞核形不規(guī)則，部分足突融合，胞核內(nèi)可見染色質(zhì)核膜分離現(xiàn)象，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊積呈環(huán)狀，有的核固縮、碎裂、呈不規(guī)則塊狀，胞質(zhì)內(nèi)線粒體凝集和腫脹，嵴排列紊亂、斷裂，甚至可見空泡樣變(圖2)。

四、各組大鼠腎臟組織GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達的變化

對照組及ANP組3、6、12、24 h組大鼠腎組織GSK-3β蛋白相對表達量分別為0.702±0.044、0.876±0.017、0.872±0.034、0.855±0.035、0.852±0.032；p-GSK-3β表達量為0.626±0.029、0.790±0.029、0.616±0.021、0.448±0.028、0.439±0.017(圖3)；p-GSK-3β/GSK-3β比值為0.933±0.041、0.868±0.031、0.712±0.054、0.528±0.051、0.516±0.015。ANP各時點組腎組織GSK-3β蛋白表達均較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，但ANP各時點組間的差異均無統(tǒng)計學意義。p-GSK-3β表達在造模后3 h升高，以后逐漸下降，其中ANP 3 h組顯著高于對照組及ANP其他時點組，ANP 12、24 h組顯著低于對照組及ANP 3、6 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而ANP 6 h組與對照組，ANP 12 h組與24 h組間的差異均無統(tǒng)計學意義。ANP 3 h組的p-GSK-3β/GSK-3β比值與對照組的差異無統(tǒng)計學意義，而ANP 6、12、24 h組均較對照組顯著降低，ANP 12、24 h組又較6 h組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

表1 對照組及ANP組大鼠血清學指標的變化

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP 3 h組比較，bP<0.05；與ANP 6 h組比較，cP<0.05

圖1 對照組(1A)及ANP 3、6、12、24 h組(1B、1C、1D、1E)大鼠胰腺(上)及腎臟(下)組織病理學改變(HE ×200)

組別只數(shù)胰腺組織腎臟組織對照組120．6±0．233．9±1．6ANP3h組126．5±0．3a109．0±4．6a 6h組129．9±0．5ab236．8±10．9ab 12h組1212．6±0．4abc320．9±10．1abc 24h組1214．7±0．3abcd350．4±13．3abc

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP 3 h組比較，bP<0.05；與ANP 6 h組比較，cP<0.05；與ANP 12 h組比較，dP<0.05

圖2 對照組(2A)及ANP組(2B)大鼠腎臟組織的超微結構變化

圖3 對照組(1)及ANP 3、6、12、24 h組(2、3、4、5)大鼠腎組織GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達

討 論

研究表明，GSK-3β在炎癥相關疾病的細胞壞死和器官衰竭中起著極其重要的作用[4]。Hoeflich等[7]報道在GSK-3β基因敲除小鼠肝再生模型中，其炎癥因子表達情況與NF-κB基因敲除小鼠表達相似，但血清TNF-α、IL-6水平明顯低于對照組。Cuzzocrea等[8]報道，抑制AP小鼠GSK-3β表達可降低血清淀粉酶和脂肪酶活性，下調(diào)炎癥細胞因子表達，并減輕胰腺的病理損傷，對AP時多器官損傷和功能障礙起到保護作用，并有效降低死亡率。

已有研究表明，GSK-3β在靜止的細胞中處于活性狀態(tài)，在受到外界刺激后，其活性可增強，但是GSK-3β位于N末端的絲氨酸殘基(GSK-3β Ser9)被磷酸化后，其活性可被抑制。GSK-3β的磷酸化可被各種因素，如缺氧、特異性抑制劑TDZD-8、非特異性抑制劑丙戊酸鈉等調(diào)控而抑制活性。GSK-3β也可被上游信號如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、AP-1、蛋白激酶C (PKC)、蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶B(PKB/AKT)等轉導通路調(diào)控。目前研究顯示，由胰島素或胰島素樣生長因子誘導的PI3K/Akt信號轉導通路為GSK-3β的主要調(diào)節(jié)因素，可導致GSK-3β的絲氨酸殘基磷酸化而失去活性[9-10]。

本研究結果顯示，ANP3h組大鼠腎組織GSK-3β蛋白表達較對照組顯著增高，且未隨著病程進展進一步升高，而是維持在較高水平；而p-GSK-3β ser9在造模后一過性表達增高，隨著病程進展逐漸下降，推測可能與ANP時同時啟動機體保護機制有關。ANP時PI3K/AKT信號轉導通路被激活，導致GSK-3β的絲氨酸殘基磷酸化，p-GSK-3β表達增高，但是隨著病情進展，導致GSK-3β磷酸化的保護機制可能受到抑制，從而使p-GSK-3β表達降低。本研究結果提示，GSK-3β不僅參與ANP時全身炎癥進展，也參與ANP并發(fā)的急性腎損傷的發(fā)病過程，而p-GSK-3β表達變化可能在ANP并發(fā)的腎損傷病情進展中發(fā)揮更重要的作用。但其更為確切的分子機制還需做更深入的研究。

[1] Zhou J, Li Y, Tang Y. Effect of acute kidney injury on mortality and hospital stay in patient with severe acute pancreatitis[J]. Nephrology,2015,20(7):485-491. DOI:10.1111/nep.12439.

[2] Zhang XP, Wang L, Zhou YF. The pathogenic mechanism of severe acute pancreatitis complicated with renal injury: A review of current knowledge[J]. Dig Dis Sci, 2008, 53(2): 297-306. DOI:10.1007/s10620-007-9866-5.

[3] Takada Y, Fang X, Jamaluddin MS, et al. Genetic deletion of glycogen synthase kinase-3 beta abrogates activation of I kappa B alpha kinase, JNK, Akt, and p44/p42 MAPK but potentiates apoptosis induced by tumor necrosis factor[J]. J Biol Chem, 2004, 279(38): 39541-39554. DOI:10.1074/jbc.M403449200.

[4] Dugo L, Collin M, Allen DA, et al. GSK-3 beta inhibitors attenuate the organ injury/dysfunction caused by endotoxemia in the rat[J]. Crit Care Med, 2005, 33(9): 1903-1912.

[5] Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg, 1992, 215(1): 44-56.

[6] Paller MS, Hoidal JR, Ferris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J]. J Clin Invest, 1984, 74(4): 1156-1164. DOI:10.1172/JCI111524.

[7] Hoeflich KP, Luo J, Rubie EA, et al. Requirement for glycogen synthase kinase-3 beta in cell survival and NF-kappa B activation[J]. Nature, 2000, 406(6791): 86-90. DOI: 10.1038/ 35017574.

[8] Cuzzocrea S, Malleo G, Genovese T, et al. Effects of glycogen synthase kinase-3 beta inhibition on the development of cerulein-induced acute pancreatitis in mice[J]. Critical Care Medicine, 2007, 35(12):2811-2821.

[9] Simao F, Matte A, Pagnussat AS, et al. Resveratrol prevents CA1 neurons against ischemic injury by parallel modulation of both GSK-3 beta and CREB through PI3-K/Akt pathways[J]. Eur J Neurosci, 2012, 36(7): 2899-2905. DOI: 10.1111/j.1460-9568. 2012.08229.x.

[10] Duarte AI, Santos P, Oliveira CR, et al. Insulin neuroprotection against oxidative stress is mediated by Akt and GSK-3 beta signaling pathways and changes in protein expression [J]. Biochimi Biophy Acta, 2008, 1783(6): 994-1002. DOI:10.1016/j.bbamcr.2008.02.016.

(本文編輯：屠振興)

Expressionofglycogensynthasekinase-3βinrenaldamageofacutenecrotizingpancreatitisanditsmechanism

ZhaoKailiang,Chenchen,ShiQiao,Zhaoliang,MeiFangchao,Wangping,WangWeixing.

DepartmentofHepatobiliaryandLaparoscopicSurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:WangWeixing,Email:sate.llite@163.com

ObjectiveTo observe the changes of tissue morphology and ultrastructure of kidney in the rat model of acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate the protein expression of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β) and phosphorylated GSK-3βin renal tissue.MethodsSixty SPF male SD rats were randomly divided into 5 groups (n=12 for each group) according to random number method, including control group, ANP 3 h, 6 h, 12 h, 24 h groups. ANP model was established by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate solution into the biliopancreatic duct. Rats were sacrificed at corresponding time points to collect pancreatic and left renal tissue. Serum amylase (AMY), lipase (LIPA), creatinine (Cr) and urea nitrogen (BUN) levels were detected. Pancreatic and renal tissues were routinely pathologically examined.

Rephrocytes′ ultrastructure changes were observed by projection electron microscope. GSK-3β protein expression and phosphorylated GSK-3β(p-GSK-3β) in kidney tissue were quantified by Western-blot.ResultsSerum AMY, LIPA, Cr, Bun and pathological scores for pancreatic and renal tissues in ANP groups were obviously higher than those in control group, which increased gradually with the progress of pancreatitis. In ANP rats, it was observed that the microvilli on the surface of the epithelial cells of renal tubules were swelling and irregularly arranged, the nucleus was condensed and broken, the nuclear chromatin was condensed and separated from the nuclear membrane, the mitochondria was condensed, swelling and vacuolated. The expression levels of GSK-3β protein in the renal tissue of the control group and ANP 3 h, 6 h, 12 h, 24 h groups were 0.702±0.044, 0.876±0.017, 0.872±0.034, 0.855±0.035 and 0.852±0.032, respectively. The expression levels of p-GSK-3β were 0.626±0.029, 0.790±0.029, 0.616±0.021, 0.448±0.028 and 0.439±0.017. GSK-3β protein expression was higher in ANP group than in control group, and the difference was statistically significant (allP<0.05). But there was no statistically significant difference at different time points in ANP group. p-GSK-3β protein expression increased at 3 h after modeling, and then gradually decreased. p-GSK-3β protein expression was higher in ANP 3 h group than control group and other ANP groups, which in ANP 12 h, 24 h group was obviously lower than control group and ANP 3 h, 6 h group, and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionsGSK-3β expression in the kidney of ANP rats began to increase at 3 h after modeling and maintain a high level. p-GSK-3β was transiently increased at 3 h after modeling and then gradually decreased to a level obviously lower than control group. It indicated that these changes may play a crucial role in ANP associated kidney injury.

Pancreatitis, acute necrotizing; Acute kidney injury; Glycogen synthase kinase-3β

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.05.004

430060 武漢，武漢大學人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科

王衛(wèi)星，Email: sate.llite@163.com

國家自然科學基金面上項目(81370562)；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助(青年教師資助項目，2042015kf0086)

2017-01-04)