楊 琳，邵 茵，王莉菲

(廣東省深圳市人民醫(yī)院婦科 518000)

Notch信號(hào)通路在胰島素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡中的作用

楊 琳，邵 茵△，王莉菲

(廣東省深圳市人民醫(yī)院婦科 518000)

子宮內(nèi)膜腫瘤；胰島素；γ分泌酶抑制劑MW167；Notch信號(hào)；細(xì)胞增殖

子宮內(nèi)膜癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的25%～30%，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐漸上升且具有年輕化趨勢(shì)[1]。胰島素作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化過(guò)程[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，胰島素抵抗及高胰島素血癥在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病及病情進(jìn)展中起重要作用[3-4]，但其內(nèi)在機(jī)制尚不明確。近年來(lái)研究顯示，相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展[5]。Notch信號(hào)通路是細(xì)胞間相互接觸的信號(hào)通路之一，可調(diào)控多種細(xì)胞分化、增殖及凋亡，且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，并可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。因此，本研究從細(xì)胞與細(xì)胞間聯(lián)系的信號(hào)傳導(dǎo)通路及調(diào)節(jié)機(jī)制方面，探討γ分泌酶抑制劑MW167抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)后對(duì)胰島素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及相關(guān)凋亡蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞(上海一研生物科技有限公司)。

表1 MW167抑制劑拮抗胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與胰島素組比較；△：P<0.05，與MW167組(5 μmol/L)比較；▽：P<0.05，與MW167組(10 μmol/L)比較

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 γ分泌酶抑制劑MW167(美國(guó)MCE公司)；Notch蛋白試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(上海依赫生物科技有限公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(上海拓然生物科技有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT,上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；新生牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3克隆抗體、兔抗人Caspase-8克隆抗體(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：DMLP-MP30，日本Ricoh公司)；20、200、1 000 μL微量移液器(芬蘭DragonMed公司)；臺(tái)式微量離心機(jī)(型號(hào)：H1650-W，美國(guó)Sigma公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：A1330103，美國(guó)Beckman公司)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(型號(hào)：TD-35M/TD35；德國(guó)Hettich公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：MCO-20AIC，德國(guó)Heraeus公司)；電子天平(BP211D型，德國(guó)Sartorius公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào)：DG-3022型，國(guó)營(yíng)華東電子管廠)；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：1401-X-20R，美國(guó)Beckman-Coulter公司)。

1.2方法

1.2.1子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞的培養(yǎng) 在無(wú)菌操作條件下取子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞，置于含10%胎牛血清(100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)RPMI-1640培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，傳代時(shí)依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min，收集懸浮液離心過(guò)濾后留取沉淀物，繼續(xù)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～4 d傳代1次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2MTT比色法測(cè)定子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞 取對(duì)數(shù)期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，每孔加入100 μL新生胎牛血清，將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為：對(duì)照組(加入磷酸緩沖液3 mL)、胰島素組(加入1×106mol/L胰島素單獨(dú)刺激)及MW167組(分別應(yīng)用5、10、20 μmol/L γ分泌酶抑制劑MW167預(yù)處理后再用胰島素刺激)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24、48、72 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)恒溫孵育4 h，將培養(yǎng)液去掉，依次加入經(jīng)生物素標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液于室溫孵育。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)量樣品在570 nm處的吸光度(A570)值，并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測(cè)定子宮內(nèi)膜癌相關(guān)凋亡蛋白及Notch1蛋白 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將細(xì)胞分為對(duì)照組(加入磷酸緩沖液3 mL)、胰島素組(加入1×106mol/L胰島素單獨(dú)刺激)及MW167組(分別應(yīng)用5、10、20 μmol/L γ分泌酶抑制劑MW167預(yù)處理后再用胰島素刺激)，每組培養(yǎng)48 h后收集貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，將蛋白凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，于室溫下采用含5%脫脂奶粉Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉1 h，并加入鼠抗人Caspase-3及鼠抗人Caspase-8，于4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST洗滌樣品，加入經(jīng)辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，在常溫下孵育1 h后采用TBST洗滌3次，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定硝酸纖維素膜上Caspase-3、Caspase-8及Notch1蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1MW167抑制劑拮抗胰島素促Ishikawa 3-H-12細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá) 胰島素可促進(jìn)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)，刺激48 h后Notch1蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，MW167可抑制胰島素誘導(dǎo)Notch1蛋白表達(dá)，且抑制作用具有時(shí)間及濃度依賴性，見(jiàn)表1、圖1。

1：對(duì)照組；2：胰島素組；3：MW167組(5 μmol/L)；4：MW167組(10 μmol/L)；5：MW167組(20 μmol/L)

圖1 MW167抑制劑拮抗胰島素對(duì)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)

圖2 MW167抑制劑拮抗胰島素調(diào)節(jié)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞增殖作用

表2 MW167抑制劑拮抗胰島素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與胰島素組比較；△：P<0.05，與MW167組(5 μmol/L)比較；▽：P<0.05，與MW167組(10 μmol/L)比較

表3 抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)胰島素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與胰島素組比較；△：P<0.05，與MW167組(5 μmol/L)比較；▽：P<0.05，與MW167組(10 μmol/L)比較

2.2MW167抑制劑拮抗胰島素調(diào)節(jié)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞增殖作用 MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示，不同組別Ishikawa 3-H-12細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h后A570值存在明顯差異(P<0.05)，其中胰島素組各時(shí)間點(diǎn)A570值均高于對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖在48 h時(shí)達(dá)到最高水平。MW167以濃度及時(shí)間依賴的方式抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，在48 h時(shí)以20 μmol/L MW167可持久抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表2、圖2。

2.3抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)胰島素誘導(dǎo)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，胰島素組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其中以48 h刺激作用最為明顯，在培養(yǎng)48 h后胰島素組Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)水平降至最低，直至培養(yǎng)72 h后仍維持較低的表達(dá)水平，MW167以濃度及時(shí)間依賴的方式促進(jìn)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)，見(jiàn)表3、圖3。

1：對(duì)照組；2：胰島素組；3：MW167組(5 μmol/L)；4：MW167組(10 μmol/L)；5：MW167組(20 μmol/L)

圖3抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)胰島素誘導(dǎo)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胰島素不僅可調(diào)節(jié)糖脂代謝，還可作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)控細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。胰島素可與胰島素受體(INSR)結(jié)合并活化其生物學(xué)效應(yīng)，從而刺激細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及抑制凋亡，誘發(fā)多種腫瘤發(fā)生[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)結(jié)腸癌小鼠注射胰島素后腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快[7]。孫恒子等[8]研究發(fā)現(xiàn)，血清胰島素水平與乳腺癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，高胰島素血癥是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過(guò)降低血清胰島素水平可有效延長(zhǎng)乳腺癌患者的生存時(shí)間，降低乳腺癌復(fù)發(fā)率。另有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中大量存在INSR，且INSR水平與子宮內(nèi)膜癌的復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移及生存率有密切的關(guān)系[9]。

目前關(guān)于胰島素在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制尚不明確。但是相關(guān)研究認(rèn)為，胰島素可經(jīng)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中Notch信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡，該信號(hào)通路異常激活可刺激腫瘤血管形成及促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，并與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)有密切的關(guān)系[10]。目前多項(xiàng)研究均表明，Notch可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)惡性腫瘤的生成及進(jìn)展[11-12]。Mi等[13]研究指出，應(yīng)用γ分泌酶抑制劑MW167能有效抑制Notch信號(hào)通路傳導(dǎo)，進(jìn)而可阻斷Notch誘導(dǎo)的低氧條件下癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下Notch信號(hào)通路已被激活，表現(xiàn)為Notch1蛋白表達(dá)水平升高。在胰島素刺激下，Notch1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，而隨著γ分泌酶抑制劑MW167作用時(shí)間及濃度增加，Ishikawa 3-H-12細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平下降。MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示，不同組別Ishikawa 3-H-12細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h 后A570值存在明顯差異(P<0.05)，其中胰島素組各時(shí)間點(diǎn)A570值均高于對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)，胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖在48 h時(shí)達(dá)到最高水平。MW167以濃度及時(shí)間依賴的方式抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，在48 h時(shí)20 μmol/L MW167可持久抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。由此可推測(cè)促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)與胰島素刺激下Notch信號(hào)通路進(jìn)一步激活有關(guān)。Sparling等[14]研究證實(shí)，在胰島素培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中存在Notch過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，Notch過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)，支持了本研究結(jié)果。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，具有重要的生物學(xué)意義。Caspase-3、Caspase-8是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者及主要效應(yīng)因子，在凋亡執(zhí)行階段主要負(fù)責(zé)對(duì)部分或全部關(guān)鍵性蛋白進(jìn)行酶切，使之滅活。活化的Caspase-3、Caspase-8可特異性切割DNA，并參與DNA損傷修復(fù)及DNA滅活過(guò)程，從而激活核酸及促使染色體凝固，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究經(jīng)Western blot檢測(cè)顯示，胰島素組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)，其中以48 h刺激作用最為顯著，在培養(yǎng)48 h后胰島素組Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)水平最低，直至培養(yǎng)72 h仍維持較低的表達(dá)水平，MW167以濃度及時(shí)間依賴的方式促進(jìn)Ishikawa 3-H-12細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)，表明胰島素可抑制Ishikawa 3-H-12細(xì)胞凋亡，其可能的作用機(jī)制為胰島素可激活Notch信號(hào)通路，抑制相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，而MW167可抑制胰島素誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

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TheroleofNotchsignalingpathwayininsulinregulationofendometrialcancercellgrowthandapoptosis

YangLin，ShaoYin△，WangLifei

(DepartmentofGynaecology,thePeople′sHospitalofShenzhenCity,Shenzhen,Guangdong518000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Notch signaling pathway on proliferation of insulin-induced endometrial carcinoma cells and apoptosis related protein expression levels.MethodsThe endometrial carcinoma Ishikawa 3-H-12 cell line was primarily cultured and subcultured in vitro.Then,the cultured cells were divided into five groups:the control group (3 mL PBS was added into the group),the insulin group (cells were stimulated by 1×106mol/L insulin) and MW167 groups (different doses of γ-secretase inhibitor MW167 pretreated with insulin stimulation).After 48 h culturation,inhibition of endometrial carcinoma cell growth of each group was measured by MTT-colorimetric method,the apoptosis-related proteins (Caspase-3,Caspase-8) and Notch1 protein expression levels of each group were determined by Western blot.ResultsInsulin can promote Notch1 protein expression in endometrial carcinoma cells,after 48 h insulin stimulation,the Notch1 protein expression level was significantly higher than that in the control group (P<0.05).MW167 can inhibit insulin-induced Notch1 protein expression in a concentration-dependent inhibition manner.The absorbance at 570 nm (A570) of endometrial carcinoma cells cultured for 24,48 and 72 h in different groups were significantly different (P<0.05).TheA570values in the insulin group at each time point were higher than those in the control group (P<0.05),and the insulin-induced endometrial carcinoma cell proliferation reached its highest level at 48 h.MW167 inhibited insulin-induced endometrial carcinoma cells proliferation in a concentration- and time-dependent manner,and 20 μmol/L MW167 persistently inhibited insulin-induced proliferation of endometrial carcinoma cells at 48 h.Western blot analysis showed that expression levels of Caspase-3 and Caspase-8 protein in the insulin group at each time point were lower than those in the control group (P<0.05),and MW167 promoted the expressions of Caspase-3 and Caspase-8 in a concentration-and time-dependent manner.ConclusionMW167 can suppress the insulin-induced endometrial carcinoma cells proliferation and promote the expression of related apoptotic proteins by inhibiting Notch signaling pathway,and induce apoptosis of endometrial carcinoma cells.

endometrial neoplasms；insulin；γ-secretase inhibitor MW167；Notch signaling；cell proliferation

楊琳(1975-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事婦科腫瘤研究?！?/p>

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.005

目的探討抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)胰島素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平的影響。方法將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細(xì)胞行體外原代及傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為：對(duì)照組(加入磷酸鹽緩沖液3 mL)、胰島素組(加入1×106mol/L胰島素單獨(dú)刺激)及MW167組(應(yīng)用不同劑量γ分泌酶抑制劑MW167預(yù)處理后再用胰島素刺激)，培養(yǎng)48 h后應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測(cè)定半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8及Notch1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果胰島素可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)，刺激48 h后Notch1蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，MW167可抑制胰島素誘導(dǎo)Notch1蛋白表達(dá)，且抑制作用具有濃度依賴性。不同組別子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h后570 nm處吸光度(A570)值存在明顯差異(P<0.05)，其中胰島素組各時(shí)間點(diǎn)A570值均高于對(duì)照組(P<0.05)，胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖在48 h時(shí)達(dá)到最高水平。MW167以濃度及時(shí)間依賴的方式抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，在48 h時(shí)20 μmol/L MW167可持久抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。胰島素組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)，MW167以濃度及時(shí)間依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)。結(jié)論MW167可通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路傳導(dǎo)而抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

R737.33

A

1671-8348(2017)29-4047-04

2017-03-20

2017-06-18)