郝文媛，李飛武，閆偉，李蔥蔥，郝東云，郭長虹

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蛋白質(zhì)組學(xué)方法評估轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米非預(yù)期效應(yīng)

郝文媛1,2，李飛武2，閆偉2，李蔥蔥2，郝東云1,2，郭長虹1

（1哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春130033）

【】轉(zhuǎn)基因育種是將對人類有益的外源基因通過生物技術(shù)整合進(jìn)受體植物的基因組中，使其獲得通過自然進(jìn)化無法獲得優(yōu)異性狀，這是轉(zhuǎn)入外源基因的“預(yù)期效應(yīng)”。然而，外源基因插入受體植物還可能產(chǎn)生無法控制和預(yù)期的細(xì)胞、代謝或表型等方面的改變，即“非預(yù)期效應(yīng)”。非預(yù)期效應(yīng)是轉(zhuǎn)基因植物安全評價(jià)的核心內(nèi)容之一，也是近年來研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究以抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米為材料，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較研究轉(zhuǎn)基因玉米與其非轉(zhuǎn)基因玉米之間的非預(yù)期效應(yīng)，為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)解析轉(zhuǎn)基因植物非預(yù)期效應(yīng)提供理論參考?！尽窟x取4份已經(jīng)進(jìn)入中國農(nóng)業(yè)部安全評價(jià)階段轉(zhuǎn)蘇云芽孢桿菌（，Bt）內(nèi)毒素基因的抗蟲玉米材料，即SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd，以及它們的對照玉米材料鄭單958和鄭58，分別種植于可控人工溫室中。待玉米幼苗生長至5葉1心期時(shí)，每份材料取長勢一致的6個(gè)單株最上部完全展開葉片，混合作為一個(gè)樣本進(jìn)行取樣，并提取葉片蛋白質(zhì)。雙向電泳技術(shù)分別分離4種轉(zhuǎn)基因玉米和它們各自對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因材料高豐度蛋白質(zhì)組，利用Image Scanner掃描儀掃描脫色后的蛋白質(zhì)凝膠，PD Quest 8.0軟件（Biorad，USA）分析蛋白質(zhì)凝膠圖譜，以蛋白點(diǎn)相對體積（% Vol）來表述每一個(gè)匹配蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度，將電泳凝膠上特異性蛋白質(zhì)和相對體積大于2倍的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)取樣，依據(jù)相應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并對鑒定出的特異性和差異性蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞功能富集分析（GO）和代謝途徑富集分析（KEGG），以評價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的可能非預(yù)期效應(yīng)。【】通過比較4種不同轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏母哓S度蛋白質(zhì)組，除目標(biāo)抗蟲基因外，共鑒定出61個(gè)蛋白質(zhì)，其功能主要是富集于光合作用、碳固定、能量轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)細(xì)胞功能相關(guān)酶類，如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP合成酶、丙酮酸磷酸雙激酶等。僅有少數(shù)幾個(gè)與光合作用、碳固定和ATP合成途徑等基礎(chǔ)代謝過程相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。KEGG分析表明，與對照ZD958相比，SK12-5zd的差異蛋白在光合生物碳固定途徑中顯著富集；Bt799zd的差異蛋白則分別在光合生物碳固定途徑、光合作用和碳代謝途徑中顯著富集。與對照Z58相比，IE034z和Bt799z的差異蛋白均在光合作用代謝途徑中顯著富集。證明4種轉(zhuǎn)基因材料與對照蛋白質(zhì)組相似性較高，未見基因的異常表達(dá)?！尽繙y試的4種轉(zhuǎn)基因材料在蛋白質(zhì)水平未發(fā)生影響其安全性的非預(yù)期效應(yīng)；當(dāng)前結(jié)果表明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以用來驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植物的非預(yù)期效應(yīng)。

轉(zhuǎn)基因玉米；蛋白質(zhì)組學(xué)；非預(yù)期效應(yīng)；雙向電泳；差異表達(dá)蛋白

0 引言

【研究意義】植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的目標(biāo)是將有利于植物自身或滿足人類需求的特定外源基因整合進(jìn)入受體植物基因組中，使其獲得外源基因所表現(xiàn)的特定性狀并能夠穩(wěn)定遺傳。這些性狀就是轉(zhuǎn)基因植物的目標(biāo)性狀，也稱為預(yù)期效應(yīng)。由于外源基因整合位點(diǎn)不確定，加之外源基因產(chǎn)物本身也可能使受體植物的能量代謝和物質(zhì)代謝發(fā)生變化，從而影響其固有的生理代謝過程，乃至改變受體植物的固有性狀。這些性狀改變均是轉(zhuǎn)基因育種設(shè)計(jì)過程中無法控制和預(yù)期的，這些無法控制和預(yù)期的性狀改變均稱為非預(yù)期效應(yīng)[1-2]?？梢?，轉(zhuǎn)基因植物實(shí)際上是外源基因發(fā)揮預(yù)期的目標(biāo)效應(yīng)和受體植物基因組因外源基因的導(dǎo)入，而產(chǎn)生的非預(yù)期效應(yīng)的綜合體。轉(zhuǎn)基因植物是否會產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)，以及對非預(yù)期效應(yīng)的安全性評估一直是科學(xué)家和公眾對轉(zhuǎn)基因植物廣泛關(guān)注的話題。長期以來，各國相關(guān)部門都是基于1993年歐洲經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織OECD（Organization for Economic Co-operation and Development）提出的“實(shí)質(zhì)等同性原則”對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行安全性評價(jià)的，評價(jià)的核心是比較轉(zhuǎn)基因植物與其非轉(zhuǎn)基因受體植物間在農(nóng)藝性狀、環(huán)境適應(yīng)性、營養(yǎng)及物質(zhì)組成變化等的差異，以確認(rèn)或排除轉(zhuǎn)基因植物是否存在非預(yù)期效應(yīng)。傳統(tǒng)的檢測方法不僅難以全面涵蓋轉(zhuǎn)基因植物可能出現(xiàn)的非預(yù)期效應(yīng)，且檢測指標(biāo)有限、檢測費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。因此，建立全面、快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測技術(shù)是分析鑒定轉(zhuǎn)基因生物安全性的關(guān)鍵所在[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，蛋白質(zhì)組分析技術(shù)迅速發(fā)展，雙向電泳技術(shù)、iTRAQ技術(shù)等已成為當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)[4]。研究人員已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆等材料中，對蛋白質(zhì)組水平上的非預(yù)期效應(yīng)的進(jìn)行了評估，取得了較好的效果[5-11]。轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化生產(chǎn)以來，已占全球轉(zhuǎn)基因作物種植總面積的30%，居轉(zhuǎn)基因作物的第二位，涉及的農(nóng)藝性狀主要為玉米螟抗性，轉(zhuǎn)入的基因?yàn)榉N類繁多的來自蘇云芽孢桿菌（，Bt）的昆蟲內(nèi)毒素基因[12-15]（本文統(tǒng)稱“Bt基因”）。Coll等[5]利用2D凝膠電泳、質(zhì)譜技術(shù)分析比較，發(fā)現(xiàn)在同一地塊種植的2種轉(zhuǎn)Bt基因玉米MON810與其對照株系的籽粒蛋白質(zhì)組幾乎一致，只有幾個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)有1—1.8倍的變化，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米MON810與其對照非轉(zhuǎn)基因材料具有實(shí)質(zhì)等同性；Albo等[6]也發(fā)現(xiàn)MON810與其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏淖蚜５鞍踪|(zhì)組之間非預(yù)期差異基本等同；Zolla等[7]發(fā)現(xiàn)同一田間生長的MON810及其對照同一品系的不同世代材料的蛋白質(zhì)組存在顯著差異，且在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上，環(huán)境因素對非預(yù)期變異效應(yīng)的貢獻(xiàn)比轉(zhuǎn)基因插入更大。上述研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已逐漸成為檢測轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)的有效方法[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲玉米材料不但在目標(biāo)基因上明顯不同，而且由于受體材料差異和回交轉(zhuǎn)育過程的不同，造成了最終的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米材料間存在著巨大的差異。這些遺傳背景上的差異是否會產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)仍研究甚少，目前的研究還主要集中在Bt基因的抗蟲目標(biāo)預(yù)期效應(yīng)上[17-22]。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米SK12-5、IE034、Bt799z和 Bt799zd是中國自主研發(fā)的具有潛在產(chǎn)業(yè)化前景的轉(zhuǎn)基因新材料，圍繞上述新材料已開展了大量育種研發(fā)工作及所獲相應(yīng)育種材料的環(huán)境安全[23-25]和食用安全評價(jià)研究，但是，對這些材料的非預(yù)期效應(yīng)研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用雙向電泳技術(shù)對上述轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的4種不同遺傳背景材料的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了比較分析，一方面在蛋白質(zhì)組水平比較不同轉(zhuǎn)基因材料的差異；另一方面從組學(xué)的水平初步評估了實(shí)驗(yàn)材料蛋白水平上是否發(fā)生了影響轉(zhuǎn)基因材料安全性的非預(yù)期效應(yīng)，為非預(yù)期效應(yīng)評價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：編號1#為具有轉(zhuǎn)并有ZD958遺傳背景的雜交種SK12-5zd，由浙江大學(xué)提供。編號2#為轉(zhuǎn)并有Z58遺傳背景的自交系IE034z，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。編號3#為轉(zhuǎn)并有Z58遺傳背景的自交系Bt799z，編號4#為轉(zhuǎn)并有ZD958遺傳背景的雜交種Bt799zd，均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。選取非轉(zhuǎn)基因的自交系Z58和雜交種ZD958作為對照材料，編號分別為5#和6#。編號2#和3#的轉(zhuǎn)基因自交系是目標(biāo)遺傳轉(zhuǎn)化體經(jīng)2代自交后，再與Z58材料進(jìn)行6代回交轉(zhuǎn)育后獲得了具有純合、穩(wěn)定遺傳背景的轉(zhuǎn)基因自交系。上述轉(zhuǎn)基因材料均已采用國家發(fā)布的轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了外源基因分子特征鑒定，證明均為獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，并已進(jìn)入環(huán)境釋放以上的轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)試驗(yàn)階段。

2014年6月，將試驗(yàn)材料種植在吉林省公主嶺市的吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的人工溫室中，幼苗長至5葉1心期進(jìn)行取樣，每種試驗(yàn)材料取長勢基本一致的6個(gè)單株的最上部完全展開葉片，混合作為一個(gè)樣本。液氮冷凍后，迅速放入干冰中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。

1.2 玉米葉片總蛋白提取

將葉片去主脈后剪成1 cm的小段，稱取0.5 g葉片加入50 mg PVPP進(jìn)行充分研磨；加入7.5 mL經(jīng)-20℃預(yù)冷的蛋白提取緩沖液Ⅰ，冰浴研磨5 min，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的10 mL離心管中，-20℃放置1 h；4℃，13 000 r/min離心45 min，棄上清；加入7.5 mL經(jīng)-20℃預(yù)冷的蛋白質(zhì)提取液Ⅱ，懸浮振蕩，-20℃放置1 h；4℃，13 000 r/min離心45 min，棄上清，重復(fù)2次；加入7.5 mL 80%預(yù)冷的丙酮，充分懸浮后，離心去上清；沉淀真空干燥并稱重。每種材料各重復(fù)3次，獲得的蛋白用Bradford法[26]測定濃度后準(zhǔn)備進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳分析。

1.3 蛋白質(zhì)等點(diǎn)聚焦

采用長度24 cm，pH 3—10的線性干膠條（Biorad，美國），取蛋白提取液與水化緩沖液（8 mol·L-1Urea、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、0.002%溴酚藍(lán)，用前加入65 mmol·L-1DTT和0.2% IPG Buffer）混合至總體積450 μL（含蛋白質(zhì)約為1 200 μg），采用被動水化的方法處理18 h。將水化后的膠條轉(zhuǎn)移到等電聚焦槽上（膠條酸性端置聚焦盤的“+”端，堿性端置聚焦盤“-”端）。每根膠條加入3 mL礦物油，將潤濕的濾紙1/3處放在膠條的兩端夾上電極夾，扣緊聚焦盤，等點(diǎn)聚焦程序和參數(shù)設(shè)置參照Biorad產(chǎn)品說明書。等點(diǎn)聚焦結(jié)束后，將膠條置于平衡緩沖液（6 mol·L-1Urea、75 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.8）、2% SDS、25%甘油、0.002%溴酚藍(lán)）振蕩平衡2次，每次15 min。第一次平衡在緩沖液中加入1% DDT；第二次平衡在緩沖液加入2.5%碘乙酰胺（IAM）。平衡完畢后取出膠條輕輕用平衡緩沖液潤洗，然后去除多余的平衡緩沖液，準(zhǔn)備SDS-PAGE電泳。

1.4 SDS-PAGE

將平衡好的膠條置于第二向凝膠上方，排除氣泡使二者緊密接觸，用1%瓊脂糖凝膠封固膠條，接通電源。第一階段1 W/gel運(yùn)行1 h；第二階段13 W/gel運(yùn)行直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底端。雙向電泳結(jié)束后，SDS-PAGE凝膠置于固定液（10%冰醋酸、40%甲醇、50%超純水）中固定3 h；凝膠固定后，超純水沖洗3次，每次15 min；加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色（0.12% G-250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%甲醇）振蕩過夜；超純水脫色至背景滿意為止。

1.5 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫分析

Image Scanner掃描儀掃描脫色后的凝膠，用Biorad PDQuest 8.0軟件分析不同玉米葉片材料的凝膠圖譜，采用Yang等[4]的方法，使用蛋白相對表達(dá)體積（% Vol）來表述每一個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)豐度。差異蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度分析分別以Z58和ZD958材料的凝膠作為參考膠，只有蛋白質(zhì)點(diǎn)在至少2個(gè)重復(fù)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)才被認(rèn)為是真實(shí)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。定義平均相對表達(dá)豐度上調(diào)（出現(xiàn)）或下調(diào)（消失）差異大于2倍（ratio＞2），并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)上＜0.05的蛋白質(zhì)為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。差異蛋白質(zhì)點(diǎn)使用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀LC-Q-TOF-MS 6520（Agilent Technologies，USA）進(jìn)行分析。使用NCBI玉米數(shù)據(jù)庫（NCBI，Taxonomy：，Entry：212235，2015/01/20）對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢索。蛋白檢索結(jié)果的顯著性判別標(biāo)準(zhǔn)：一般認(rèn)為PMF（Peptide Mass Fingerprinting，肽指紋圖譜）在MS/MS檢索中離子分?jǐn)?shù)≥88分說明該蛋白的鑒定結(jié)果有效，其他一些輔助標(biāo)準(zhǔn)包括至少10%的序列覆蓋率以及需要有3個(gè)肽段的匹配[27]。

1.6 GO和KEGG分析

采用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）方法對質(zhì)譜鑒定出的特異性蛋白（E value≤10?5）與NCBI non-redundant（Nr）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，確定相應(yīng)的蛋白質(zhì)并獲得對應(yīng)的基因信息，用DAVID方法對這些表達(dá)有差異的基因進(jìn)行基因功能注釋（gene ontology，GO）分析[28]，對差異蛋白功能及代謝途徑進(jìn)行KEGG通路分析[29]。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)蛋白的分離及鑒定

為了比較不同轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米蛋白質(zhì)組差異，對供試材料的葉片總蛋白進(jìn)行了雙向電泳分析。結(jié)果顯示，各受試材料均可檢測到超過1 200個(gè)清晰蛋白點(diǎn)（圖1）。

將電泳膠圖掃描后使用Biorad PDQuest8.0軟件對每個(gè)轉(zhuǎn)基因材料及其對照（1#和6#、4#和6#、2#和5#、3#和5#）進(jìn)行比較，對電泳凝膠上相對表達(dá)體積超過2倍的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜儀分析，成功鑒定玉米基因組蛋白61個(gè)（圖2、表1）。進(jìn)一步分析特異蛋白點(diǎn)（只在轉(zhuǎn)基因與對照的一個(gè)材料中出現(xiàn)）和差異蛋白點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，這些蛋白點(diǎn)中核酮糖二磷酸羧化酶相關(guān)蛋白點(diǎn)15個(gè)，ATP合酶類蛋白點(diǎn)4個(gè)，放氧增強(qiáng)蛋白點(diǎn)13個(gè)，丙酮酸磷酸雙激酶相關(guān)蛋白點(diǎn)3個(gè)，GADPH酶相關(guān)蛋白點(diǎn)2個(gè)，類萌發(fā)素蛋白相關(guān)蛋白點(diǎn)4個(gè)，草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白點(diǎn)2個(gè)（3#和4#），其他蛋白點(diǎn)6個(gè)，未知功能蛋白點(diǎn)10個(gè)。這些蛋白所涉及的生化反應(yīng)過程主要集中在光合作用、碳固定和能量代謝等方面。根據(jù)不同蛋白的功能以及質(zhì)譜檢測結(jié)果，對各類蛋白在不同轉(zhuǎn)基因材料中變化的趨勢進(jìn)行了匯總分析（表2）。結(jié)果顯示，在4種轉(zhuǎn)基因玉米材料中發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為參與植物對逆境脅迫響應(yīng)的類萌發(fā)素類蛋白均有顯著的表達(dá)升高；而只有質(zhì)體藍(lán)素鈉一類蛋白在4#材料中發(fā)生了表達(dá)顯著降低；涉及光合作用及碳固定的相關(guān)酶類，如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP合成酶、丙酮酸磷酸雙激酶等均發(fā)生了表達(dá)顯著上調(diào)。在同為ZD958背景的1#和4#材料中，包括類萌發(fā)素蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、PSⅡ的放氧增強(qiáng)蛋白的表達(dá)均發(fā)生了顯著的升高；而在同為Z58背景的2#和3#材料中，包括ATP合成酶、放氧增強(qiáng)蛋白、類萌發(fā)素蛋白、肽基脯氨酰順反式異構(gòu)酶等蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著升高?？梢钥闯鲞z傳背景相同的轉(zhuǎn)基因玉米材料（1#和4#、2#和3#）在轉(zhuǎn)入不同抗蟲Bt基因后，其所引起的蛋白水平上的變化也存在著一定的一致性。而不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因材料（3#和4#）轉(zhuǎn)入相同抗蟲Bt基因后，其蛋白水平上的表達(dá)變化則差異較大。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米及其對照葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳對比分析

表1 轉(zhuǎn)基因玉米葉片與對照的差異表達(dá)蛋白

此外，對4份轉(zhuǎn)基因材料獲得的特異蛋白點(diǎn)與轉(zhuǎn)基因材料中所轉(zhuǎn)入的Bt蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了特異蛋白點(diǎn)#3802、#4719、#3707、#3708分別對應(yīng)Bt蛋白cry1Ab、cry1Ie、mcry1Ac、mcry1Ac（圖1）。說明轉(zhuǎn)基因材料中轉(zhuǎn)入的Bt基因在玉米中能夠正常表達(dá)，并且這些Bt蛋白能夠通過雙向電泳被分離和鑒定，最終體現(xiàn)在蛋白質(zhì)組分析所獲得的特異蛋白點(diǎn)中。

2.2 差異蛋白的GO分析和KEGG分析

雖然通過BLASTx對試驗(yàn)所得的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了初步鑒定，獲得了蛋白信息，但這些蛋白在是否在細(xì)胞組成、生物途徑和分子功能上具有共性，是否富集于某一代謝途徑，仍無法準(zhǔn)確推斷。通過對這些差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和代謝通路富集分別進(jìn)行GO（圖3）和KEGG分析（圖4）。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料與對照材料相比雖有差異，但也主要集中在光合作用相關(guān)蛋白，并未發(fā)現(xiàn)特殊蛋白或特殊代謝途徑的明顯改變。SK12-5zd與ZD958比較發(fā)現(xiàn)，共有5個(gè)不同生物途徑的相關(guān)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，分別為光合作用（photosynthesis）相關(guān)蛋白3個(gè)、還原型戊糖磷酸循環(huán)途徑（reductive pentose-phosphate cycle）相關(guān)蛋白2個(gè)、鈣離子結(jié)合（calcium ion binding）蛋白2個(gè)、不同細(xì)胞組成相關(guān)蛋白4個(gè)（具體為膜外蛋白（extrinsic component of membrane）2個(gè)和光合系統(tǒng)Ⅱ放氧復(fù)合體（photosystem Ⅱ oxygen evolving complex）相關(guān)蛋白2個(gè)。

Bt799zd與ZD958比較發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)不同生物途徑相關(guān)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，分別為光合作用相關(guān)蛋白4個(gè)，光呼吸（photorespiration）相關(guān)蛋白質(zhì)2個(gè)和碳固定途徑（carbon fixation）相關(guān)蛋白2個(gè)；發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同分子功能的蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，分別為2個(gè)核酮糖-二磷酸羧化酶的活性蛋白（ribulose- bisphosphate carboxylase activity）和2個(gè)單加氧酶活性蛋白（monooxygenase activity）；按照細(xì)胞組成分析也發(fā)現(xiàn)了4個(gè)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，分別為膜外蛋白（extrinsic component of membrane）2個(gè)和光合系統(tǒng)Ⅱ放氧復(fù)合體（photosystem II oxygen evolving complex）相關(guān)蛋白2個(gè)。

IE034z與Z58比較發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)不同生物途徑相關(guān)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，均屬于光合途徑相關(guān)蛋白；有5個(gè)細(xì)胞組成相關(guān)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，分別為膜外蛋白3個(gè)和光合系統(tǒng)Ⅱ放氧復(fù)合體相關(guān)蛋白2個(gè)；按照分子功能分析則發(fā)現(xiàn)了鈣離子結(jié)合的蛋白發(fā)生了差異表達(dá)3個(gè)。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米差異表達(dá)蛋白匯總

Bt799z與Z58比較發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)生物途徑相關(guān)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，均屬于光合途徑相關(guān)蛋白；按照細(xì)胞組成分析有6個(gè)蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，分別為膜外蛋白3個(gè)和光合系統(tǒng)Ⅱ放氧復(fù)合體相關(guān)蛋白3個(gè)；還發(fā)現(xiàn)有3個(gè)分子功能為鈣離子結(jié)合的蛋白發(fā)生了差異表達(dá)。

通過2倍上下調(diào)控表達(dá)水平來篩選轉(zhuǎn)基因材料與其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧系牟町惖鞍踪|(zhì)進(jìn)行KEGG分析則發(fā)現(xiàn)，在SK12-5zd與ZD958的比較中，差異蛋白在光合生物碳固定途徑（carbon fixation in photosynthetic organisms）中顯著富集；而在Bt799zd和ZD958的比較中，差異蛋白則分別在光合生物碳固定途徑、光合作用和碳代謝（carbon metabolism）幾個(gè)代謝途徑中顯著富集。在IE034z和Z58以及Bt799z和Z58的比較中均為光合作用代謝途徑中的差異蛋白顯著富集（圖4）。

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米葉片與其對照的差異蛋白GO分析

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米葉片與其對照的差異蛋白KEGG分析

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)和推廣，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的分析鑒定，以及轉(zhuǎn)入基因的直接表達(dá)產(chǎn)物和間接調(diào)控產(chǎn)物對轉(zhuǎn)基因生物生長發(fā)育、生態(tài)環(huán)境、食物鏈及人類食品安全的影響越來越受到關(guān)注。由于現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因生物中多數(shù)外源基因的表達(dá)或調(diào)控產(chǎn)物都是蛋白質(zhì)，因而在蛋白質(zhì)水平上對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行評價(jià)顯得尤為重要，蛋白質(zhì)組學(xué)的興起和發(fā)展為在蛋白質(zhì)水平上對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行評價(jià)提供了可能[30-31]。

本研究對4種轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米材料及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩撞牧线M(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析。每份材料經(jīng)雙向電泳凝膠分離后均可檢測到1 200個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，利用PDQuest8.0軟件對蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行分析，已檢測到4份轉(zhuǎn)基因材料與對照之間差異表達(dá)的Bt殺蟲蛋白，還鑒定出61個(gè)表達(dá)量發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)，主要集中于光合作用、同化物的積累及能量代謝過程。不同轉(zhuǎn)基因材料中均檢測到光合生物碳固定途徑中的差異蛋白，如光合作用中決定碳同化速率的關(guān)鍵酶——核酮糖1,5-二磷酸羧化酶、C4植物光合作用途徑中二氧化碳固定的關(guān)鍵酶——丙酮酸磷酸雙激酶、放氧增強(qiáng)蛋白；植物中對逆境響應(yīng)的類萌發(fā)素蛋白、以及ATP合成酶類等在4個(gè)轉(zhuǎn)基因材料中均有顯著的上調(diào)表達(dá)，這些差異蛋白不僅是遺傳背景的差異，可能也與轉(zhuǎn)基因玉米具有抗蟲性相關(guān)，而GO分析和KEGG分析的結(jié)果也證實(shí)了上述差異的存在。理論上光合作用的增強(qiáng)，生物體抗逆能力增強(qiáng)，生長會更健壯，植物的光合能力也會提高，這有待于后期對材料的觀察和分析；同時(shí)光合作用和碳固定過程增強(qiáng)，均涉及大量的能量物質(zhì)流動，這些能量物質(zhì)的去向與外源蛋白的表達(dá)是否存在關(guān)聯(lián)，有待深入分析。

本研究發(fā)現(xiàn)類萌發(fā)素蛋白在所有轉(zhuǎn)基因材料中均有顯著的上調(diào)表達(dá)，該蛋白是在植物中普遍存在的位于胞外基質(zhì)的可溶性糖蛋白，絕大多數(shù)為穩(wěn)定的低聚物，其作用為參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)。這類蛋白的上調(diào)表達(dá)可能預(yù)示著抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米材料中，除依賴表達(dá)針對靶標(biāo)生物的毒蛋白已達(dá)到抗蟲的目的外，還可能存在某種共有的變化機(jī)制，對其他逆境脅迫響應(yīng)產(chǎn)生作用，而具體作用機(jī)制需通過后續(xù)的逆境脅迫響應(yīng)評估及分析深入研究。

轉(zhuǎn)基因作物的蛋白質(zhì)組差異一方面是由于外源基因的插入造成的，另一方面還有可能由環(huán)境因素造成[7]。本研究材料均在溫室內(nèi)培養(yǎng)至5葉1心期，極大程度地避免了環(huán)境因素的影響，其結(jié)果所反應(yīng)出的差異應(yīng)主要為外源基因插入造成的蛋白質(zhì)組差異。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)受體材料的遺傳背景可能影響轉(zhuǎn)基因材料的蛋白表達(dá)差異。本研究中所用的轉(zhuǎn)基因自交系材料均是經(jīng)過高世代選育獲得的穩(wěn)定材料，其基因組差異極小，因此，在與其回交親本材料比較中所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)差異，應(yīng)主要來源于外源基因的插入及表達(dá)所引起的蛋白質(zhì)組變化。研究結(jié)果也證明在相同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因材料中，其蛋白表達(dá)變化的一致性較高，而經(jīng)過雜交配制的轉(zhuǎn)基因雜交種材料，由于雜交過程中的不確定性，外源基因的表達(dá)和雜交過程均會對蛋白質(zhì)組產(chǎn)生影響，因此導(dǎo)致檢測出了更多的差異表達(dá)蛋白，本研究結(jié)果也再次證實(shí)了不同遺傳背景但轉(zhuǎn)入相同基因的材料間（3#和4#）其蛋白水平上的表達(dá)差異較大。這與抗蟲玉米Mon810的相關(guān)蛋白質(zhì)組的比較分析結(jié)果基本一致，即在轉(zhuǎn)基因玉米個(gè)體的蛋白質(zhì)表達(dá)譜之間沒有顯著的個(gè)體差異，其主要差異源于基因組遺傳背景的差異[5-7]。

抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米生物安全評價(jià)過程中非常重視其食用和飼用安全性。綜合分析本研究結(jié)果，在4份轉(zhuǎn)基因玉米材料中并沒有發(fā)現(xiàn)影響其食用或飼用安全的新蛋白，未發(fā)現(xiàn)植物生理、生化和代謝過程中發(fā)揮重要功能的蛋白質(zhì)或致敏和毒素蛋白質(zhì)產(chǎn)生或發(fā)生明顯的表達(dá)變化。由于蛋白質(zhì)是具有生物功能的特殊大分子物質(zhì)，轉(zhuǎn)基因植物的食用安全性變化會直接體現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上。本研究表明抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米在蛋白質(zhì)水平上并未產(chǎn)生可檢出的影響其安全性的蛋白成分。轉(zhuǎn)基因材料中發(fā)生變化的蛋白多集中于光合作用、同化物的積累及能量代謝過程，這些過程也與轉(zhuǎn)基因材料安全性關(guān)系小，并非影響轉(zhuǎn)基因材料安全性的非預(yù)期效應(yīng)。

4 結(jié)論

SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd等4種轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米材料與對照蛋白質(zhì)組相似性較高，僅有少數(shù)幾個(gè)與光合作用、碳固定和ATP合成途徑等基礎(chǔ)代謝過程相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，但未見基因的異常表達(dá)。測試的4種轉(zhuǎn)基因材料在蛋白質(zhì)水平未發(fā)生影響其安全性的非預(yù)期效應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

assessment of the unintended effects of four genetically modified Maize varieties by Proteomic approach

Hao WenYuan1,2, Li FeiWu2, Yan Wei2, Li CongCong2, Hao DongYun1,2, Guo ChangHong1

(1College of Life Sciences and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025;2)

【】Unintended effects of genetically modified (GM) crops are defined as the unexpected trait changes in GM breeding and research. Over the last decade, much attention has been taken to GM crops’ intended effects that are attributed to the insertion of foreign gene, leaving the unintended effects of GM crops less investigated. In this study, a comparative proteomic study using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry was conducted to assess the high-abundant protein variation, so as to explore possible occurrence of their unintended effects.【】Four insect resistant GM maize varieties, i.e SK12-5zd, IE034z, Bt799z and Bt799zd, which were under approval of GM safety assessment by the Ministry of Agriculture, were planted in a condition-controlled greenhouse together with their corresponding CKs, i.e Zheng58 and Zhengdan958. When seedling growing into 5-leaf stage, the top-leaf blades of each maize variety were sampled and their leaf proteins were extracted. After profiling by two-dimensional electrophoresis, on-gel leaf protein spots of each GM maize were compared against their corresponding CKs using Imager Scanner and PD Quest 8.0 (Biored, USA). The resulted unique and differential protein (with a relative volume greater than 2-fold) spots were isolated from the gel and applied for protein identification by mass spectrometry against the relevant protein database. The identified proteins were analyzed in gene ontology (GO) and KEGG for their cellular functionalities and metabolism pathway enrichment. 【】Through comparison of the unique and differential proteins between each GM maize and its corresponding no-GM CKs among 4 insect resistant GM maize varieties, a total of 61 differential proteins were identified in maize PDB (NCBI) alongside the 4 intended insect resistant gene products. The gene ontology analyses of the identified proteins revealed that they are popular cellular enzymes of fundamental metabolism, i.e Rubisco, ATP synthase, pyruvate orthophosphate dikinase, etc. Only a few genes relating to photosynthesis, ATP synthesis and carbon fixation were observed to be up-expressed, possibly due to the genetic background difference between the GM maize and its CK. KEGG analyses uncovered that, in comparison with the corresponding CKs, the differential proteins of SK12-5zd and Bt799zd were enriched similarly into photosynthesis, carbon fixation and metabolism pathways. In comparison with the CK Z58, the differential proteins of both IE034z and Bt799z were enriched into the photosynthetic metabolism pathway.Four GM maize varieties exhibited extensive similarity over their corresponding wild-type controls. It appeared to be no unintended effects observed. 【】The preliminary results revealed no obvious unintended effects in 4 insect resistant GM maize varieties in respect to high-abundant proteomic assessment.

genetically modified maize; proteomics; unintended effects; two-dimensional electrophoresis (2-DE); differentially expressed protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.003

2017-03-20；接受日期：2017-05-03

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2015ZX08013003）

郝文媛，E-mail：wenyuan_h@163.com。通信作者郭長虹，E-mail：kaku2008@hotmail.com。通信作者郝東云，E-mail：dyhao@cjaas.com