涂仁杰,金文標(biāo),韓松芳,周 旭,陳洪一

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離子注入突變?cè)逯暝诔鞘形鬯械漠a(chǎn)油特性

涂仁杰,金文標(biāo)*,韓松芳,周 旭,陳洪一

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院,深圳微藻生物能源工程實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳 518055)

考察了蛋白核小球藻出發(fā)株及其離子注入突變株在實(shí)際城市污水中的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)脂性能,以及對(duì)污染物的去除能力.結(jié)果表明,突變?cè)逯暝谖鬯杏椭a(chǎn)率為32.5mg/(L·d),相比于出發(fā)株分別顯著提高了23.81%(<0.05).通過(guò)對(duì)生成的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析,結(jié)果顯示離子注入誘變并未改變小球藻脂肪酸成分,但提升了單不飽和脂肪酸的含量,有利于改善所得生物柴油的品質(zhì).培養(yǎng)結(jié)束后出水水質(zhì)可達(dá)到一級(jí)A排放標(biāo)準(zhǔn),相較于出發(fā)株,突變株對(duì)污水中污染物具有更好的降解效果.利用掃描電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)出發(fā)株和突變株藻細(xì)胞形態(tài)差異較小,元素含量分析發(fā)現(xiàn)突變株H/C值相比出發(fā)株有所下降,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建說(shuō)明突變株與出發(fā)株屬于同種變異.

離子注入；城市污水；小球藻；油脂產(chǎn)量

隨著能源危機(jī)與環(huán)境污染的加劇,微藻生物柴油越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[1-3].微藻培養(yǎng)是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié),在微藻培養(yǎng)過(guò)程中,利用淡水培養(yǎng)需消耗大量淡水資源,有悖于當(dāng)前淡水資源緊缺的背景.同時(shí),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的投加進(jìn)一步提高了微藻的培養(yǎng)成本[4-5].微藻生長(zhǎng)需要消耗大量無(wú)機(jī)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),城市生活污水中又有大量氮、磷需要去除,利用城市污水培養(yǎng)微藻可以將二者有機(jī)結(jié)合起來(lái).微藻通過(guò)光合作用能夠產(chǎn)生較高濃度的O2,可用于污水處理廠曝氣池曝氣,為活性污泥中微生物的呼吸作用提供O2,而微生物的呼吸作用又能夠產(chǎn)生較高濃度的CO2,可為微藻生長(zhǎng)提供無(wú)機(jī)碳源[6].研究表明利用微藻可以凈化污水,污水也可以用來(lái)培養(yǎng)微藻[7-9].

由于城市污水成分復(fù)雜,含有大量的微生物,微藻與細(xì)菌之間存在著互生、拮抗等復(fù)雜的相互關(guān)系[10].不同藻種對(duì)環(huán)境需求不同,對(duì)污水的耐受性也不同[11-12].隨著微藻生物能源的快速發(fā)展,迫切需要利用技術(shù)手段,對(duì)自然環(huán)境中篩選分離的產(chǎn)油藻種,進(jìn)行誘變處理以獲取品質(zhì)更加優(yōu)良的藻種.因此,前期通過(guò)離子注入法對(duì)蛋白核小球藻進(jìn)行了誘變,本研究將通過(guò)考察小球藻出發(fā)株及其離子注入突變株在實(shí)際城市污水中的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)脂性能,以及對(duì)污染物的去除效果,以確定突變?cè)逯陮?duì)實(shí)際污水的適應(yīng)性,為利用城市污水規(guī)模化培養(yǎng)能源微藻的研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用微藻為課題組前期經(jīng)離子注入法誘變篩選的蛋白核小球藻誘變株(CVM)[13],藻種采用BG11培養(yǎng)基[14]進(jìn)行傳代培養(yǎng)保藏.實(shí)驗(yàn)所用城市污水取自深圳大學(xué)城市政污水井,經(jīng)潛污泵抽取后使用,污水水質(zhì)如下:COD、NH4+-N、TN和TP的濃度分別為140~200mg/L、20~ 40mg/L、20~45mg/L和5.0~6.5mg/L.以BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻種子液,接種于600mL城市污水中,于氣泡柱式光生物反應(yīng)器(直徑5cm、高50cm、容積約為1L)培養(yǎng),以相應(yīng)未加小球藻的城市污水為空白對(duì)照,使扣除空白后藻液初始吸光度680=0.1,于培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強(qiáng)度為100mmol/(m2·s).光暗比為12h:12h條件下,連續(xù)通氣培養(yǎng)(空氣流速為120mL/min,由底部通入).取培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的藻液測(cè)定藻細(xì)胞的干重和油脂產(chǎn)量.每組實(shí)驗(yàn)各設(shè)3個(gè)平行.

1.2 微藻干重的測(cè)定

接種初期藻液的干重為0(g/L),培養(yǎng)一定時(shí)間(d)后,取穩(wěn)定期藻液10mL經(jīng)0.45μm微孔濾膜(1)過(guò)濾、洗滌,于105℃下烘至恒重(2/g),微藻干重DW (g/(L·d))的計(jì)算公式如下:

DW=[(2-1)/0.01-0]/

1.3 微藻油脂產(chǎn)量與脂肪酸組成的測(cè)定

微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶劑提取法[15].待提取結(jié)束后,收集氯仿相,轉(zhuǎn)移至預(yù)稱重的錫紙盤(pán)中,待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后,于80℃烘箱中烘至恒重,前后重量差即微藻油脂產(chǎn)量,微藻細(xì)胞油脂含量為油脂產(chǎn)量與微藻干重的百分比.

微藻脂肪酸分析,首先對(duì)提取的油脂進(jìn)行甲酯化[16],將5mL藻液中脂肪酸轉(zhuǎn)化成相對(duì)應(yīng)的脂肪酸甲酯.采用賽里安456-GC氣相色譜儀進(jìn)行分析,色譜柱為BR-2560柱,100m′0.25mm(內(nèi)徑)′0.20μm(膜厚),FID檢測(cè)器,分流方式進(jìn)樣,分流比為30:1,進(jìn)樣量為1μL.

1.4 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

污水水質(zhì)采用國(guó)標(biāo)法[17]測(cè)定,取微藻培養(yǎng)結(jié)束后的藻液于8000r/min離心10min,收集上清液測(cè)定.污水中COD、NH4+-N、TN和TP的分別按照GB 11914-89、GB 7479-87、GB 11894-89和GB 11893-89進(jìn)行測(cè)定[18-21].

1.5 藻細(xì)胞的掃描電鏡觀察

樣品前處理使用0.1mol/L磷酸緩沖液離心漂洗3次.1%鋨酸固定90min,0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗離心漂洗3次,0.2μm微孔濾膜過(guò)濾.酒精梯度脫水,在30%、50%、70%、80%、100%依次脫水,其中100%酒精2次,每次10min.乙酸異戊脂置換,50%1次,100%2次.Eiko公司XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥,Eiko公司IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜,JEOL公司JSM-6390LV掃描電鏡觀察.

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS21.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(<0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 突變?cè)逯暝谖鬯械男阅芸疾?/h3>

2.1.1 突變?cè)逯暝谖鬯械纳L(zhǎng)情況 將突變株和出發(fā)株按照藻液初始吸光度680=0.1接種到城市污水中,每天取樣測(cè)定扣除空白后藻液的680以監(jiān)測(cè)藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況(圖1).從圖1可知,小球藻出發(fā)株和突變株在城市污水中的生長(zhǎng)符合典型的微生物生長(zhǎng)曲線.從第1d開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第6d進(jìn)入穩(wěn)定期生長(zhǎng)階段,穩(wěn)定期持續(xù)4d,第9d開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì).突變株的比生長(zhǎng)速率為0.26,680最高可達(dá)2.2,而出發(fā)株的比生長(zhǎng)速率為0.2,680最高可達(dá)1.7.可見(jiàn),通過(guò)離子注入誘變可以提高小球藻在城市污水中的生長(zhǎng)速率.但由于實(shí)際污水水質(zhì)的不穩(wěn)定性,小球藻在不同批次污水中生長(zhǎng)情況不盡相同,因此,用實(shí)際污水培養(yǎng)小球藻時(shí),選擇收集培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的藻液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.1.2 突變?cè)逯暝谖鬯械漠a(chǎn)脂情況 相同培養(yǎng)條件下,取穩(wěn)定期的藻液測(cè)其微藻生物質(zhì)和油脂產(chǎn)率,并計(jì)算得到油脂含量,如圖2所示.從圖2中可以看出,穩(wěn)定期生物質(zhì)產(chǎn)量和油脂產(chǎn)率分別為109.5mg/(L·d)和32.5mg/(L·d),相比于出發(fā)株分別顯著提高了35.47%和23.81% (<0.05),油脂含量略有降低,但無(wú)顯著性差異.更快的生長(zhǎng)速率和更高的油脂產(chǎn)率,是利用微藻生產(chǎn)生物柴油的重要要求.結(jié)果說(shuō)明離子注入誘變可以提高小球藻對(duì)污水適應(yīng)性以及產(chǎn)油能力.

圖1 出發(fā)株和突變株在城市污水中的生長(zhǎng)情況

圖2 出發(fā)株和突變株在城市污水中的產(chǎn)脂情況

微藻的油脂產(chǎn)量是判定藻種作為生物柴油原料優(yōu)劣的重要指標(biāo),微藻的油脂產(chǎn)量由干重和微藻油脂含量共同決定.在適宜生長(zhǎng)的環(huán)境條件下,微藻會(huì)大量繁殖并積累數(shù)目可觀的生物量,此時(shí)油脂積累量相對(duì)較低,僅占生物量干重的5%~ 20%.在不利或脅迫環(huán)境下,微藻的油脂含量顯著升高,可占生物量干重的20%~50%.許多微藻在受到環(huán)境條件脅迫時(shí),會(huì)減緩甚至停止細(xì)胞分裂,同時(shí)加速油脂或其他次級(jí)代謝物的合成與積累以應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境.在脅迫環(huán)境下,油脂的合成可能是微藻應(yīng)對(duì)環(huán)境逆境的一種自我保護(hù)機(jī)制.從本質(zhì)上講,微藻生物量增加和油脂合成是相互競(jìng)爭(zhēng)光合作用所產(chǎn)生的能量、還原力以及中間代謝物的兩個(gè)過(guò)程[22].結(jié)果中突變?cè)逯晟锪匡@著上升,雖然油脂含量略有降低,但最終油脂產(chǎn)量是上升的,可以為生物柴油的制備提供更多原料.此外,微藻生物量越高,藻液濃度越高,有利于藻體采收,可以降低微藻收獲成本.因此,通過(guò)離子注入誘變促進(jìn)微藻產(chǎn)脂這一思路是可行的.

表1 出發(fā)株和突變株脂肪酸分析

注:nd-未檢測(cè)出.

利用氣相色譜儀分析污水中小球藻出發(fā)株和突變株脂肪酸甲酯的組成,以進(jìn)一步確定二者的油脂品質(zhì),結(jié)果如表1所示.由表1可知,小球藻出發(fā)株和突變株的脂肪酸組成均以C16:0、C18:0、C18:2和C18:3為主,為綠藻中常見(jiàn)脂肪酸[23-24].研究表明,適合制備生物柴油的原料應(yīng)含有較多C16~C18脂肪酸[25-26].突變株中總飽和脂肪酸的比例低于出發(fā)株,而單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量高于出發(fā)株.高品位的生物柴油應(yīng)含有較多的單不飽和脂肪酸,以改善其十六烷值、低溫流動(dòng)性、氧化安定性、運(yùn)動(dòng)粘度等性能[27-29].可見(jiàn),突變?cè)逯昃邆渲苽涓咂肺簧锊裼偷臐撡|(zhì).

2.1.3 突變?cè)逯陮?duì)污染物去除能力考察 微藻培養(yǎng)結(jié)束后取適量藻液,離心后測(cè)上清液中COD、NH4+-N、TN和TP的濃度,結(jié)果如表2所示.由表2可以看出,出發(fā)株和突變株都能將污水中的COD、NH4+-N、TN和TP降解到符合 (GB18918-2002)一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)[30], 而且突變株對(duì)污水中污染物降解效果更好.由于培養(yǎng)過(guò)程中水環(huán)境呈弱堿性, 部分氨氮變成氨氣,在吹脫作用下從水中去除,導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)束后已檢測(cè)不到.

表2 城市污水培養(yǎng)微藻前后水質(zhì)

2.2 突變?cè)逯暝寮?xì)胞掃描電鏡和元素分析

2.2.1 掃描電鏡觀察 利用掃描電鏡觀察藻細(xì)胞的形態(tài)差異,結(jié)果如圖3所示.

(a)出發(fā)株

(b)突變株

圖3 出發(fā)株和突變株表觀結(jié)構(gòu)對(duì)比

Fig.3 Apparent structure comparison of wild strain and mutant strain

由圖3可以看出,突變株和出發(fā)株的細(xì)胞形態(tài)差異較小,但突變株藻細(xì)胞更接近球體.對(duì)比藻細(xì)胞胞外物質(zhì)的情況,可以發(fā)現(xiàn)出發(fā)株藻細(xì)胞之間黏附著許多不定型物質(zhì),導(dǎo)致多個(gè)藻細(xì)胞聚集在一起.而突變株胞外的不定型物質(zhì)較少,多以單個(gè)細(xì)胞形式存在,有利于細(xì)胞與環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸吸收.

2.2.2 元素含量分析 相同條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期后,將藻液離心烘干制成藻粉,測(cè)定微藻細(xì)胞的元素成分,結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可以看出,突變株和出發(fā)株在N、C、H元素百分比含量上有顯著性差異(<0.05).突變株的氮元素含量降低,可能是由于藻體油脂積累較多導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成較少.另外,分析藻株的H/C值發(fā)現(xiàn),出發(fā)株的H/C值為1.83,而突變株的H/C值為1.75.突變株H/C值相比出發(fā)株有所下降,且H/C值小于2,推斷是因?yàn)橥蛔冎曛胁伙柡投仍黾?與前述突變株中不飽和脂肪酸增加的結(jié)果相一致.

表3 出發(fā)株和突變株元素含量分析

2.3 突變?cè)逯甑姆肿由飳W(xué)鑒定

2.3.1 藻種DNA提取結(jié)果 用DNA試劑盒分別提取突變株和出發(fā)株的總DNA,利用Nanodrop 2000檢測(cè)DNA濃度和純度,結(jié)果如表4所示,突變株和出發(fā)株提取的DNA濃度合格.凝膠電泳結(jié)果如圖4所示,提取的DNA條帶較清晰,表明總DNA 提取質(zhì)量較好,可以用于PCR 擴(kuò)增.

表4 總DNA濃度和純度檢測(cè)結(jié)果

圖4 出發(fā)株和突變株的DNA凝膠電泳

2.3.2 18S rDNA基因序列的克隆 以小球藻基因組DNA 為模板,PCR 擴(kuò)增18S rDNA 基因序列,得到的PCR 產(chǎn)物,電泳結(jié)果如圖5所示. PCR 產(chǎn)物只出現(xiàn)一條明亮主帶,表明PCR 效果較好,其大小為1 700bp 左右.

圖5 PCR擴(kuò)增小球藻18S rDNA基因片段

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將GenBank中獲得相似度最高的序列與測(cè)序獲得序列結(jié)合,利用MEGA 5.10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),構(gòu)建鄰位N-J tree, Replicate設(shè)定為1000.18S克隆序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6所示.突變株(CVM)和出發(fā)株(CVW)在發(fā)育樹(shù)上的位置很接近,表明親緣關(guān)系很近,節(jié)點(diǎn)上的Bootstrap檢驗(yàn)值為100(>95),說(shuō)明構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的可信度很高,而且突變株與出發(fā)株屬于同種變異.

圖6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

3 結(jié)論

3.1 離子注入誘變可以提高小球藻在城市污水中的生長(zhǎng)速率,小球藻突變株在污水中的適應(yīng)性良好,油脂產(chǎn)率為32.5mg/(L·d),相比于出發(fā)株顯著提高了23.81% (<0.05).

3.2 突變?cè)逯曛锌傦柡椭舅岬谋壤陀诔霭l(fā)株,而單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量高于出發(fā)株,適宜作為制備生物柴油的原料.培養(yǎng)結(jié)束后污水中的COD、NH4+-N、TN和TP符合 (GB18918-2002)一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn), 而且突變株對(duì)污水中污染物降解效果更好.

3.3 掃描電鏡結(jié)果顯示突變株和出發(fā)株的細(xì)胞形態(tài)差異較小,但突變株藻細(xì)胞更接近球體.而且突變株藻細(xì)胞多以單個(gè)形式存在,有利于細(xì)胞與環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸吸收.元素含量分析發(fā)現(xiàn)突變株的H/C值相比出發(fā)株有所下降,且H/C值小于2,說(shuō)明藻株中不飽和碳?xì)滏I增加.突變株與出發(fā)株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的位置很接近,表明親緣關(guān)系很近,節(jié)點(diǎn)上的Bootstrap檢驗(yàn)值為100(>95),說(shuō)明突變株與出發(fā)株屬于同種變異.

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The characteristics of lipid production ofmutant by ion implantation through municipal wastewater cultivation.

TU Ren-jie, JIN Wen-biao*, HAN Song-fang, ZHOU Xu, CHEN Hong-yi

(Shenzhen Engineering Laboratory of Microalgal Bioenergy, Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China)., 2017,37(10)：3735~3740

The growth and lipid productivity of originaland its ion implantation mutant strains were studied. The results showed that the lipid productivity of the mutant strain was 32.5mg/(L·d), 23.81% higher than that of the original strain. According to the fatty acid methyl ester analysis by gas chromatography, ion implantation did not change the composition of fatty acid, but enhanced the content of monounsaturated fatty acids, which was conducive to the enhancement of biodiesel quality. After cultivation, the effluent quality was also found to reach the emission standard of first level A, and the mutant showed better degradation ability than the original strain. Phylogenetic tree showed that the mutant and the original strains were belonged to interspecific variation.

ion implantation；municipal wastewater；；lipid production

X172

A

1000-6923(2017)10-3735-06

涂仁杰(1985-),男,湖北漢川人,哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院博士研究生,主要從事微藻生物質(zhì)能源與污水資源化研究.發(fā)表論文8篇.

2017-03-29

深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(JCYJ20150529114024234)

* 責(zé)任作者, 教授, jinwb@hit.edu.cn