黃智華，崔永和，計(jì)思貴，蘇友波，張立猛*

（1.云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

云南烤煙根際土壤PGPR菌株的篩選與鑒定

黃智華1，崔永和1，計(jì)思貴1，蘇友波2，張立猛1*

（1.云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

為了利用本地PGPR菌株改善云南植煙土壤質(zhì)量，提高磷、鉀等元素利用率，促進(jìn)烤煙生長(zhǎng)，在云南主要植煙區(qū)采集烤煙根際土壤樣品31個(gè)，對(duì)根際土壤中的微生物進(jìn)行分離，篩選和鑒定，共獲得解磷、解鉀或促生菌共773株，進(jìn)一步篩選獲得到了10株具有較強(qiáng)解磷、解鉀或IAA促生作用的菌株。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)10個(gè)菌株分別屬于Bacillus（芽孢桿菌屬）、Paenibacillus（類芽孢桿菌屬）、Providencia（普羅威登斯菌屬）。篩選出的PGPR為微生物肥料的開(kāi)發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源，進(jìn)一步研究將關(guān)注PGPR菌株的混配以及在土壤中的定殖。

烤煙；PGPR；解磷；解鉀；IAA促生

PGPR（植物根際促生細(xì)菌）是一類自由生活在土壤或附生于植物根際的可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)利用，并能抑制有害微生物的有益菌類。1978年BURR和SCHROTH首次報(bào)道了馬鈴薯上的PGPR[1]。PGPR可以固定空氣中的氮?dú)?，溶解土壤中不能被植物直接吸收的磷素，釋放硅酸鹽礦物中的鉀素，而且還可分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗病能力。PGPR用作生物肥料的菌種，持續(xù)性好，對(duì)非再生能源消耗少，對(duì)環(huán)境、食品安全，經(jīng)濟(jì)效益高，同時(shí)可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改良鹽堿地，保持農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

PGPR肥料在小麥[3]、水稻[4]、玉米等農(nóng)作物及蔬菜上的應(yīng)用效果良好，在烤煙種植中也具有重要價(jià)值。王豹祥等[5]報(bào)道了施用PGPR菌肥能夠適當(dāng)減少化肥用量，并改善土壤微生物群落，提高烤煙抗病性。席淑雅等[6]研究發(fā)現(xiàn)烤煙根際促生菌用于烤煙漂浮育苗可明顯提高種子發(fā)芽率、成苗素質(zhì)和對(duì)煙草病害的抗性。吳秉奇等[7]研究發(fā)現(xiàn)從烤煙根際分離的拮抗菌誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)對(duì)病害的防御力，并且能有效防治煙草黑脛病。為了充分研究本地PGPR資源，獲得適用于本地土壤條件和烤煙種植的PGPR菌株，本研究在云南植煙區(qū)采集烤煙根際土壤，篩選鑒定根際土壤中PGPR菌種，為進(jìn)一步應(yīng)用PGPR菌提高烤煙品質(zhì)提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌株篩選

1.2.1 樣品采集 2015年4—5月在云南主要植煙區(qū)共采集烤煙根際土壤樣品31個(gè)，其中玉溪市14個(gè)（紅塔區(qū)3個(gè)、江川區(qū)2個(gè)、澄江縣2個(gè)、新平縣2個(gè)、峨山縣2個(gè)、華寧縣1個(gè)、元江2個(gè)），普洱市2個(gè)，昆明2個(gè)，曲靖4個(gè)，楚雄2個(gè)，大理5個(gè)，紅河2個(gè)。于烤煙旺長(zhǎng)期取樣，連根帶土采集煙株帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 根際土壤懸液的制備 小心去除煙株根系周圍的土壤，切成1 cm左右的小段，取1 g于三角瓶中，加入9 mL滅菌水，靜置20 min后150 r/min振蕩30 min，即得土壤懸浮液。吸取1 mL土壤懸浮液接入裝有9 mL無(wú)菌水試管中，用旋轉(zhuǎn)振蕩器充分振蕩，依次制備得到 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋液，80 ℃水浴30 min。

1.2.3 培養(yǎng)基及參比菌 解無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、CRA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基配制方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8-10]。在液體培養(yǎng)基成分中添加瓊脂15.0～20.0 g/L制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。參比菌種分別為分離自德根貝中的解磷菌株、生物鉀肥中的解鉀菌株和金農(nóng)肥中的IAA分泌菌株。

1.2.4 初步篩選 將土壤懸浮液分別涂布在3種選擇性培養(yǎng)基平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待平板長(zhǎng)出菌落后，分別根據(jù)是否顯示解磷圈、菌落形態(tài)是否為油滴狀和是否顯示紅色，挑選解磷、解鉀和IAA分泌菌株，冷凍保存。

1.2.5 定性測(cè)試復(fù)篩 根據(jù)解磷圈的大小確定解磷能力，根據(jù)解鉀圈的凸起大小確定解鉀能力，根據(jù)菌落紅色的深淺判斷分泌IAA能力。

1.2.6 定量測(cè)試復(fù)篩 將純化后的菌株接種至各培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至菌濃度約為 5×108/mL進(jìn)行定量復(fù)篩。無(wú)機(jī)解磷菌：取10 mL細(xì)菌懸液，加入30 mL去離子水和1 mL H2O2，砂浴鍋上加熱至粘液消失。冷卻后用定量濾紙進(jìn)行過(guò)濾，并定容至100 mL。用鉬銻抗比色法測(cè)磷含量。有機(jī)解磷菌：將細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)移至已滅菌的50 mL離心管中，超聲波破碎細(xì)菌細(xì)胞（200 W，20 min），在4 ℃下以4000 r/min離心20 min，取上清液5 mL，用鉬銻抗比色法測(cè)磷含量。解鉀菌：取5 mL細(xì)菌懸液于50 mL小三角瓶中，加入3 mL 30% H2O2，放于砂浴鍋上蒸煮并不斷攪拌，0.5 h后再加入2 mL 30% H2O2，至硅酸鹽細(xì)菌粘液消失時(shí)取下。過(guò)濾至50 mL容量瓶中并定容。利用火焰光度計(jì)測(cè)定菌液中的鉀含量。IAA促生菌：將細(xì)菌懸液5000 r/min離心5 min，取上清液6 mL，加3 mL顯色試劑，室溫顯色30 min后，于540 nm處測(cè)定IAA含量。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 候選菌株DNA的提取和16s rDNA的序列擴(kuò)增 采用CTAB/NaCl法分別對(duì)候選菌株進(jìn)行DNA提取，并采用27F和1492R通用引物擴(kuò)增16s rDNA。

1.3.2 16s rDNA序列測(cè)定和分析[11-13]PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將所得序列與NCBI GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST分析，同源性比較及種屬鑒定。應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Clustl W進(jìn)行聚類分析。

1.3.3 形態(tài)觀察 在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株平板劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行形態(tài)觀察。

菌株樣品經(jīng)過(guò)固定，清洗，干燥，用導(dǎo)電膠粘在12 mm的觀察臺(tái)上，噴金后用Phenom電鏡進(jìn)行掃描電鏡分析。

1.3.4 生理生化分析 生理生化試驗(yàn)參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版[15]。

2 結(jié) 果

2.1 菌株篩選

2.1.1 初步篩選 在云南省主要植煙區(qū)分離得到烤煙根際具有解磷、解鉀或促生作用的菌株共 773株，各地區(qū)分離菌株數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 烤煙根際解磷、解鉀或IAA促生菌篩選統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of phosphate-solubilizing,potassium-solubilizing or IAA-producing bacteria screened rom flue-cured tobacco rhizosphere

2.1.2 復(fù)篩 通過(guò)定性和定量篩選，得到了 10株具有較強(qiáng)解磷、解鉀或促生能力的菌株，各種菌株解磷、解鉀、促生作用的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10種菌株的解磷、解鉀、IAA促生能力比較Table 2 Capacity of potassium-dissolving, phosphate solubilizing and IAA secreting of 10 strains

2.2 候選菌株的鑒定

選用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增細(xì)菌的16s rDNA區(qū)域，對(duì)復(fù)篩得到的菌株中解磷、解鉀或IAA促生能力較強(qiáng)的10個(gè)菌株進(jìn)行16s rDNA序列擴(kuò)增（圖1），凝膠中明亮的條帶即16s rDNA。

圖1 細(xì)菌 16s rDNA片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜（M：分子標(biāo)記；1～10依次為：X4，X16，X56，X66，BK22，BK38，BK40，BK43，M3，CH65）Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the fragment from the 16s rDNA(M: Marker. 1 to 10: X4, X16, X56, X66, BK22,BK38, BK40, BK43, M3, CH65)

煙草根際分離得到的 10株細(xì)菌菌株經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)，BK40為Providencia rettgeri（雷氏普羅威登斯菌），M3屬于Paenibacillus（類芽孢桿菌屬），其余 X4、X16、X56、X66、BK22、BK38、BK43、CH65均為 Bacillus（芽孢桿菌屬），集中在Bacillusmegaterium（巨大芽孢桿菌）、Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌）、Bacillus thuringiensis（蘇云金芽孢桿菌）、Bacillus simplex （簡(jiǎn)單芽孢桿菌）、Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）和 Bacillus aryabhattai、Bacillus macroides幾個(gè)細(xì)菌類群（表 3）。

2.3 典型菌株X16、BK38、M3鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 各菌株的微觀形態(tài)如圖 2。菌株X16菌體桿狀，1.0～1.2 μm×1.5～2 μm，圓形。在 LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面凸起有光澤，邊緣整齊，質(zhì)地較粘。

菌株 BK38 菌體桿狀，0.7～0.9 μm×3～4 μm，圓形。在LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面凸起有光澤，邊緣整齊，質(zhì)地較粘。在LB平板需氧培養(yǎng)24 h，細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，菌落光滑，濕潤(rùn)，半透明淡黃色菌落，有氣味。

菌株 M3 菌體桿狀，大小為 0.7～0.9 μm×3～4 μm，橢圓形。在LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面凸起有光澤，邊緣整齊，質(zhì)地較粘。

圖2 典型菌株的SEM分析Fig. 2 SEM analysis of representative strains obtained from tobacco soil

表 3 烤煙根際菌株16s rDNA序列比對(duì)結(jié)果Table 3 The comparsion results of bacterial sequences from the GenBank database with the highest similarity to the sequence of 16s rDNA of each indigenous bacteria isolated from tobacco

2.3.2 生化分析 對(duì) X16、BK38和M3進(jìn)行生化分析并與標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化特性對(duì)比發(fā)現(xiàn)[14-16]，X16的生化特性與Bacillus megaterium相似，BK38的生化特性與Bacillus macroides相似[17]，M3的生化特性與Paenibacillus相似（表4）。

2.3.3 同源性分析 菌株X16、BK38和M3的16s rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI blast分析，結(jié)果顯示分別與 Bacillus megaterium、Bacillus macroides和Paenibacillus同源性為95%、96%、95%，用MEGA5.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

表4 菌株X16、BK38和M3的生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of X16、BK38 and M3 isolates

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，同是芽孢桿菌屬或其近緣屬，但菌株BK38與芽孢桿菌屬中Bacillus macroides的親緣度更接近，菌株X16與芽孢桿菌屬中的巨大芽孢桿菌親緣度更接近，達(dá)到95%，且菌株BK38和菌株X16同屬于一個(gè)亞種，親緣度明顯高于菌株M3；菌株M3與芽孢桿菌屬中的多粘芽孢桿菌親緣度更接近。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析、生理生化分析和同源分析基本確認(rèn)BK38為Bacillus macroides，X16和M3有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3 討 論

土壤質(zhì)量下降和面源污染已是目前農(nóng)業(yè)面臨的主要問(wèn)題[18]，其中一個(gè)主要的原因就是肥料過(guò)量施用。利用微生物肥料提高肥料利用率，降低肥料施用量是改善土壤質(zhì)量，促進(jìn)土壤可持續(xù)發(fā)展，解決農(nóng)業(yè)面源污染的有效途徑。微生物肥料在烤煙種植中的作用也受到廣泛的關(guān)注[19-20]。獲得優(yōu)良的微生物菌種是開(kāi)發(fā)微生物肥料的前提。

圖3 以16s rDNA序列為基礎(chǔ)的菌株X16、BK38、M3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of X16、BK38 and M3 isolates based on 16s rDNA sequence

根際是植物根系與土壤界面數(shù)毫米范圍內(nèi)，根系、土壤、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物等共同作用形成的具有獨(dú)特性能的微域環(huán)境，最早由德國(guó)科學(xué)家LORENZ HILTNER在1904年提出[21]。根際環(huán)境與植物根系相互作用強(qiáng)烈，具有根際效應(yīng)。根際微生物數(shù)量遠(yuǎn)大于非根際土壤，在微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性等方面具有重要特性[22]。其中PGPR具有固氮、解磷、解鉀、分泌抗生素和植物激素、拮抗病原物和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種功能，是微生物開(kāi)發(fā)的重要資源[23]。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的 PGPR主要包括 27個(gè)屬，其中以芽孢桿菌屬 Bacillus和假單胞菌屬Pseudomonas的種類最多[24]。與煙草相關(guān)的 PGPR主要有微桿菌屬 Microbacterium、香味菌屬M(fèi)yroides、伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia、腸桿菌屬 Enterobacter、泛菌屬 Pantoea、克雷伯氏菌屬Klebsiella、土壤桿菌屬 Agrobacterium[25]、假單胞菌屬 Pseudomonas[26]、芽孢桿菌屬 Bacillus[27]。本研究中所鑒定的菌株中大部分屬于Bacillus也符合這一特點(diǎn)。

本項(xiàng)目所篩選獲得的PGPR菌株，分別具有解磷、解鉀或IAA分泌功能，對(duì)各種菌株進(jìn)行混配后，獲得了同時(shí)具有解磷、解鉀、分泌IAA功能的微生物菌肥，施入土壤后對(duì)烤煙生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。PGPR能否在土壤中的定殖是PGPR菌肥能否發(fā)揮作用的關(guān)鍵。研究表明不同的土壤肥力條件對(duì)PGPR的定殖影響較大[28-30]，因此在后續(xù)研究中應(yīng)針對(duì)篩選出的PGPR菌株配套合理的施肥措施。

4 結(jié) 論

本研究在云南主要植煙區(qū)采集的烤煙根際土壤中篩選獲得了具有解磷、解鉀或IAA促生功能的菌株共773株，并進(jìn)一步篩選獲得到了10株具有較強(qiáng)解磷、解鉀或IAA促生作用的菌株。篩選獲得的10株菌株有8株屬于Bacillus（芽孢桿菌屬），1株屬于 Paenibacillus（類芽孢桿菌屬），1株屬于Providencia rettgeri（雷氏普羅威登斯菌）。結(jié)合菌種形態(tài)特征、生理生化特性和16s rDNA測(cè)序分析，基本確定菌株BK38為Bacillus macrolides。篩選出的PGPR菌株為進(jìn)一步的混配和微生物肥料的開(kāi)發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

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Isolation and Identification of PGPR Strains from Rhizosphere Soil of Yunnan Flue-cured Tobacco

HUANG Zhihua1, CUI Yonghe1, JI Sigui1, SU Youbo2, ZHANG Limeng1*
(1. Yunnan Tobacco Company, Yuxi Branch, Biological Control for Tobacco Diseases and Insect Pests Engineering Research Center of China Tobacco, Yuxi, Yunnan 653100, China; 2. College of Resource and Environment, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

To improve the quality of tobacco-planting soil, the utilization rate of fertilizer and finally the quality of tobacco in Yunnan Province by local PGPR, rhizosphere soil samples were collected from the main tobacco-planting fields of Yunnan Province.Rhizosphere bacteria were isolated, screened and identified from soil samples. Capacity of potassium-dissolving, phosphate solubilizing and IAA secreting of bacteria were focused. Morphological observation, biochemical analysis and 16s rDNA sequencing were used to identify the species of PGPR candidates. In result, 31 samples of rhizosphere soil were collected from cities of Yuxi,Kunming, Qujing, Honghe, Chuxiong, Dali, and 773 strains of PGPR were isolated from these soil samples. Ten effective strains were obtained after further screening. The strains belongs to Bacillus, Paenibacillus and Providencia. This research provides resource of excellent PGPR strains for further development of microbial fertilizer. Further works will focus on the mixture and colonization research of these PGPR candidates.

flue-cured tobacco; PGPR; phosphorus-solubilizing; potassium-dissolving; IAA-secreting

S435.72

1007-5119（2017）05-0018-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.004

云南省煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目“烤煙根際解磷解鉀促生菌PGPR的篩選及應(yīng)用推廣”（2012YN43），“密集種植煙區(qū)土壤保育及煙葉質(zhì)量提升技術(shù)研究與應(yīng)用”（2017YN17）

黃智華（1987-），男，農(nóng)藝師，博士，主要從事煙草栽培方面研究。E-mail：huangzhihua0930@126.com。*通信作者，E-mail：zlm.d@163.com

2017-05-17

2017-09-11