呼鐵民 齊寶柱 田 甜 楊國軍 王昆鵬 周敬君 季東鑫 王維興

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

1 秦皇島市青龍滿族自治縣醫(yī)院 2 承德市第六醫(yī)院

人腦膠質(zhì)瘤中ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg的表達及免疫調(diào)節(jié)機制

呼鐵民 齊寶柱 田 甜 楊國軍 王昆鵬 周敬君1季東鑫2王維興

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

目的探討人腦膠質(zhì)瘤中解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)17、表皮生長因子受體(EGFR)和CD4+CD25+Treg的表達及免疫調(diào)節(jié)機制。方法選取人腦膠質(zhì)瘤標本52例，其中Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質(zhì)瘤)19例，Ⅲ～Ⅳ級(高度惡性膠質(zhì)瘤)33例；另取10例因顱腦損傷行手術(shù)治療切取的正常腦組織標本為對照組。免疫組化染色觀察標本組織中ADAM17、EGFR蛋白陽性表達情況；Western印跡和RT-PCR檢測其中ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表達量；流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg細胞比率。結(jié)果膠質(zhì)瘤組織中ADAM17蛋白陽性表達率明顯高于正常腦組織(P<0.01)；高度惡性組織明顯高于低度惡性組織(P<0.05)。腦膠質(zhì)瘤組織ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表達量明顯高于正常腦組織；高度惡性腦組織表達量明顯高于低度惡性腦組織(P<0.01)。腦膠質(zhì)瘤組織CD4+CD25+Treg細胞比率明顯高于正常腦組織，且隨惡性程度增加而升高(P<0.01)。腦膠質(zhì)瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白和mRNA表達水平均與CD4+CD25+Treg細胞比率呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg在人腦膠質(zhì)瘤中高表達且與病理分級相關(guān)；ADAM17、EGFR可能通過誘發(fā)CD4+CD25+Treg的負性免疫調(diào)節(jié)而減弱免疫監(jiān)視，促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

人腦膠質(zhì)瘤；表皮生長因子受體解聚素-金屬蛋白酶(ADAM17)；表皮生長因子受體(EGFR)；免疫調(diào)節(jié)

解聚素-金屬蛋白酶(ADAM)17屬于細胞膜表面糖蛋白，具有蛋白剪切作用，可發(fā)揮多種生物活性〔1〕。表皮生長因子受體(EGFR)屬于多功能跨膜糖蛋白，已被證實在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮神經(jīng)誘向作用〔2〕。因ADAM17、EGFR在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均發(fā)揮作用，逐漸受到該領(lǐng)域?qū)W者的重視。相關(guān)研究顯示，ADAM17、EGFR蛋白可作為經(jīng)典CD4+CD25+Treg的特異性表面標志，而CD4+CD25+Treg屬于調(diào)節(jié)性T細胞，在腫瘤免疫耐受中具有重要作用〔3〕。目前關(guān)于ADAM17、EGFR和CD4+CD25+Treg在人腦膠質(zhì)瘤方面的研究鮮有報道，本研究旨在檢測上述三者在人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達及其在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生中的免疫調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年10月在承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的人腦膠質(zhì)瘤標本52例，其中男29例，女23例，年齡57～75歲，平均(66.35±4.18)歲。按世界衛(wèi)生組織2007年頒發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標準：Ⅰ～Ⅱ級(低度惡性膠質(zhì)瘤)19例，Ⅲ～Ⅳ級(高度惡性膠質(zhì)瘤)33例。另取同年齡段10例因顱腦損傷行手術(shù)治療切取的正常腦組織標本為對照組。

1.2材料與設(shè)備 兔抗人ADAM17多克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體購于上?？道噬锟萍加邢薰?；Per CP標記的CD4抗體、FTTC標記的CD25抗體購于北京泰澤瑞達科技有限公司；RT-PCR試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，引物由上海合星生物科技有限公司合成；全自動組織處理器由德國美天旎生物技術(shù)公司生產(chǎn)；流式細胞儀由德國Partec生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1免疫組化檢測 將標本組織切片常規(guī)脫蠟、水化，放入3% 雙氧水中孵育15 min，放入枸櫞酸緩沖液中加熱10 min修復抗原，10%山羊血清封閉30 min；滴加10%封閉液稀釋的ADAM17、EGFR多克隆抗體100 μl(1∶200稀釋)，陰性對照用磷酸緩沖液代替一抗，4℃孵育過夜；滴加HRP標記的二抗，室溫下放置40 min，加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶，孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復染。光學顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為ADAM17和EGFR蛋白陽性表達，根據(jù)陽性細胞比例和染色強度分級：無陽性細胞計0分、陽性細胞<30%計1分、30%～70%計2分、>70%計3分；染色為淺黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分；兩者綜合評分：0分為陰性、1～2分為弱陽性、3～4分為陽性、5～6分為強陽性。

1.3.2Western印跡檢測 膠質(zhì)瘤組織標本放入EP管中，加入組織裂解液，4℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量，吸取100 μg總蛋白，100℃水浴10 min變性后行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目標細胞蛋白濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST液洗滌后加一抗：兔抗人ADAM17多克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(1∶500稀釋)，β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；加二抗，室溫孵育60 min，DAB顯色，Image J分析蛋白表達條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算ADAM17、EGFR蛋白的相對表達量。

1.3.3RT-PCR檢測 液氮下研碎膠質(zhì)瘤組織標本，Trizol法提取RNA，按試劑盒說明進行PCR擴增，反應體系共30 μl：Taq酶15 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物各2 μl，雙蒸水10 μl；反應條件：90℃ 10 min、94℃ 5 min、56℃ 40 s、72℃ 1 min，共40個循環(huán)。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描檢測目標條帶，以β-actin為內(nèi)參計算ADAM17 、EGFR mRNA的相對表達量。

1.3.4流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg細胞比率 使用全自動組織處理器得到膠質(zhì)瘤組織單細胞懸液，加入淋巴細胞分離液行梯度離心，收集單個核細胞層；分別加入Per CP標記的CD4抗體、FTTC標記的CD25抗體，4℃暗室孵育60 min，3 000 r/min離心棄上清，磷酸緩沖液洗滌后重懸細胞，滴加二抗，待標記完成后用流式細胞儀分選CD4+CD25+Treg細胞并計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1腦膠質(zhì)瘤中ADAM17、EGFR蛋白陽性表達情況 ADAM17、EGFR蛋白多陽性表達于細胞質(zhì)，在正常腦組織中陽性表達率為30.00%(3/10)、40.00%(4/10)，均為弱陽性。腦膠質(zhì)瘤組織中陽性表達率為86.53%(45/52)、94.23%(49/52)，其中低度惡性組織中陽性表達率為73.68%(14/19)、78.95%(15/19)，主要為陽性表達；高度惡性組織中陽性表達率為93.94%(31/33)、96.97%(32/33)，主要為強陽性表達。膠質(zhì)瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白陽性表達率明顯高于正常腦組織(P<0.01)；高度惡性組織明顯高于低度惡性組織(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 不同惡性程度腦膠質(zhì)瘤中ADAM17蛋白陽性表達情況(×400)

圖2 不同惡性程度腦膠質(zhì)瘤中EGFR蛋白陽性表達情況(×400)

2.2腦膠質(zhì)瘤中ADAM17、EGFR蛋白表達量 正常腦組織、低度惡性腦組織、高度惡性腦組織中ADAM17蛋白相對表達量分別為(0.17±0.05)、(0.33±0.07)、(0.79±0.16)；EGFR蛋白相對表達量分別為(0.00±0.00)、(0.51±0.10)、(1.21±0.26)。腦膠質(zhì)瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白表達量明顯高于正常腦組織；高度惡性腦組織中蛋白表達量明顯高于低度惡性腦組織(P<0.01)。見圖3。

圖3 不同惡性程度腦膠質(zhì)瘤中ADAM17、EGFR蛋白表達情況

2.3腦膠質(zhì)瘤中ADAM17、EGFR mRNA表達情況 正常腦組織、低度惡性腦組織、高度惡性腦組織中ADAM17 mRNA相對表達量分別為(0.19±0.01)、(0.65±0.03)、(1.38±0.09)；EGFR mRNA相對表達量分別為(0.01±0.00)、(0.47±0.02)、(1.10±0.06)。腦膠質(zhì)瘤組織ADAM17、EGFR mRNA相對表達量明顯高于正常腦組織；高度惡性腦組織相對表達量明顯高于低度惡性腦組織(P<0.01)。

2.4腦膠質(zhì)瘤中CD4+CD25+Treg細胞比率 正常腦組織、低度惡性腦組織、高度惡性腦組織中CD4+CD25+Treg細胞比率分別為(3.61±0.34)、(6.75±0.18)、(11.37±0.53)；腦膠質(zhì)瘤組織明顯高于正常腦組織，且隨惡性程度增加而升高(P<0.01)。

2.5相關(guān)性分析 腦膠質(zhì)瘤組織中ADAM17、EGFR蛋白表達水平與CD4+CD25+Treg細胞比率呈正相關(guān)(r=3.614、2.186，P<0.05)；ADAM17、EGFR mRNA表達水平與CD4+CD25+Treg細胞比率呈正相關(guān)(r=1.405、1.118，P<0.05)。

3 討 論

膠質(zhì)瘤是人腦中的常見腫瘤，放化療、生物治療等傳統(tǒng)手段的總體預后不理想。近年來，隨著對膠質(zhì)瘤機體免疫耐受機制的進一步研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)T細胞在病情發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔4〕，其中CD4+CD25+Treg不僅能夠抑制自身免疫性疾病發(fā)生，還參與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)，可有效抑制樹突細胞和CTL細胞的功能，抑制腫瘤抗原的呈遞與識別，降低機體的細胞免疫力，使腫瘤處于免疫逃避狀態(tài)〔5〕。同時CD4+CD25+Treg還可對輔助性T細胞(Th)1/ Th2信號通路產(chǎn)生影響，減弱Th對腫瘤細胞的殺傷作用〔6〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17、EGFR蛋白具有神經(jīng)細胞誘導作用，在神經(jīng)軸突中可檢測到其表達，與神經(jīng)發(fā)育、重塑具有相關(guān)性〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17、EGFR在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種癌細胞中均存在高表達，且與病理分級呈正相關(guān)，在癌細胞遷移、侵襲中發(fā)揮重要作用〔8〕，但目前國內(nèi)外仍鮮見ADAM17、EGFR蛋白與CD4+CD25+Treg在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及作用研究。近年來研究已經(jīng)證實腦組織并非免疫豁免器官，如腫瘤發(fā)生后會損壞血腦屏障，淋巴細胞進入中樞神經(jīng)細胞調(diào)節(jié)免疫功能；星狀膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞均在顱內(nèi)發(fā)揮免疫監(jiān)控作用〔9〕。同時膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)與免疫缺陷存在明顯關(guān)聯(lián)〔10〕。

ADAM17、EGFR是CD4+CD25+Treg的表面特異性分子，能夠誘發(fā)其免疫耐受。綜合CD4+CD25+Treg在腫瘤微環(huán)境中免疫耐受作用，可認為ADAM17、EGFR通過誘發(fā)CD4+CD25+Treg的負性免疫調(diào)節(jié)，使腫瘤細胞脫離機體免疫監(jiān)視，進而促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

1Yang Z,Zhao T,Liu Y,etal.Upregulation of tumor suppressor WWOX promotes immune response in glioma〔J〕.Cell immunol,2013;285(1/2):1-5.

2Anirban G,Malabika B,Pallab S,etal.T11 target structure exerts effector function by activating immune cells in CNS against glioma where cytokine modulation provide favorable microenvironment〔J〕.Indian J Exp Biol,2010;48(9):879-88.

3劉英姿.Treg細胞和IL-18在腦膠質(zhì)瘤中的作用研究〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學,2011.

4劉許昌,王 健.老年惡性腦膠質(zhì)瘤術(shù)后替莫唑胺化療聯(lián)合放療的近遠期療效〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(20):5835-6.

5Maes W,van Gool SW.Experimental immunotherapy for malignant glioma:lessons from two decades of research in the GL261 model〔J〕.Cancer Immunol Immunothera,2011;60(2):153-60.

6皇甫羅鍇.B7-H1在腦膠質(zhì)瘤中對Treg細胞的調(diào)節(jié)作用〔D〕.西安：第四軍醫(yī)大學,2013.

7趙 雪,宋文剛.重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的純化及生物活性研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2015;16(2):178-81.

8Xu L,Xiao H,Xu M,etal.Glioma-derived T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing molecule-4(TIM4) contributes to tumor tolerance〔J〕.J Biolog Chem,2011;286(42):36694-9.

9許昌海,金紅旭.持續(xù)性腎臟替代聯(lián)合血必凈對膿毒癥患者炎癥反應、免疫功能的影響〔J〕.中國衛(wèi)生工程學,2016;(5):499-500.

10Piotrowska MJ,Bodnar M,Poleszczuk J,etal.Mathematical modelling of immune reaction against gliomas:Sensitivity analysis and influence of delays〔J〕.Nonlinear Anal Real World Appl,2013;14(3):1601-20.

呼鐵民(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事顱內(nèi)腫瘤及顱內(nèi)動脈瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5063-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.049

〔2017-02-03修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)