張夢(mèng)云 楊曉歐 李秀華 馮翔宇 彭玉娟

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

1 滄州市人民醫(yī)院 2 泰安市第一人民醫(yī)院

曲美他嗪對(duì)慢性心力衰竭大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

張夢(mèng)云 楊曉歐 李秀華 馮翔宇1彭玉娟2

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

目的研究曲美他嗪(TMZ)對(duì)慢性心力衰竭(CHF)大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。方法通過縮窄腎上腹主動(dòng)脈建立CHF大鼠模型，選擇30只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TMZ組，每組10只。監(jiān)測各組心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，TUNEL法檢測各組腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測各組腎臟組織中Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)水平，RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA 含量。結(jié)果與模型組比較，TMZ組大鼠腎小管排列整齊，腎小管細(xì)胞水腫、脫落減少；AI和Bax蛋白、 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)；Bcl-2蛋白、 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。結(jié)論CHF時(shí)應(yīng)用TMZ可通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)腎功能，進(jìn)而改善心功能。

曲美他嗪；腎臟；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

慢性心力衰竭(CHF)時(shí)腎臟可能存在大量細(xì)胞凋亡，腎臟細(xì)胞凋亡是腎功能不全發(fā)生的重要原因之一〔1，2〕。腎功能不全在一定程度上影響并決定著CHF患者的預(yù)后，大大增加了心血管疾病的發(fā)病率和死亡率〔3〕。因此早期使用藥物干預(yù)可能抑制或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步改善心腎功能。曲美他嗪(TMZ)是臨床有效抗心肌缺血的新型代謝類藥物〔4〕，同時(shí)TMZ還可能通過阻止線粒體介導(dǎo)的凋亡通路抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生〔5〕。本文觀察CHF時(shí)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況及TMZ的抗凋亡及保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 鹽酸曲美他嗪(商品名：萬爽力)，由瑞陽制藥有限公司生產(chǎn)；TUNEL試劑盒購自美國羅氏(Roche)公司；Bax、Bcl-2兔抗多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；Bax和Bcl-2引物與Trizol購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2動(dòng)物模型的制備及分組 30只清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，全部大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和TMZ組，每組10只，模型組和TMZ組大鼠均采用腎上腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)復(fù)制CHF模型〔6〕，術(shù)后連續(xù)3 d經(jīng)腹腔注射給予20萬U/d青霉素。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)4 w，大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快、精神萎靡、食欲減退等表現(xiàn)。檢測血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)：左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg，標(biāo)志CHF模型建立成功。假手術(shù)組大鼠只分離腹主動(dòng)脈，不予結(jié)扎。TMZ組給予TMZ 10 mg·kg-1·d-1，假手術(shù)組及模型組連續(xù)4 w給予等量生理鹽水灌胃〔7〕。

1.3血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)監(jiān)測 終止大鼠觀察時(shí)檢測各組大鼠質(zhì)量，通過腹腔進(jìn)行注射麻醉，經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，通過多導(dǎo)電生理記錄儀監(jiān)測各實(shí)驗(yàn)對(duì)象的LVEDP及左室內(nèi)壓上升與下降最大速率(±dp/dtmax)，準(zhǔn)確詳細(xì)記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 取新鮮大鼠腎臟組織，用4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精下行至水、蘇木素-伊紅(HE)染色、梯度酒精上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的檢測 采用TUNEL法檢測腎臟組織細(xì)胞凋亡情況，將腎組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，切厚5 μm，嚴(yán)格按照TUNEL染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，在200倍熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察，分別對(duì)細(xì)胞凋亡數(shù)和細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并求其平均值，計(jì)算腎臟組織AI。

1.6SP法檢測腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 腎組織石蠟切片置于二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水洗10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗10 min，置入3%H2O2-甲醛溶液37℃ 30 min孵育清除內(nèi)源性過氧化氫酶活性，采用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS浸泡15 min，滴加正常山羊血清37℃ 30 min，后加Bcl-2、Bax一抗(濃度均為1∶75)，4℃過夜，第2天37℃ 30 min復(fù)溫，加二抗37℃ 40 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫37℃ 40 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。使用400倍光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，后用Imagepro Plus軟件進(jìn)行分析，以陽性表達(dá)產(chǎn)物面積與視野總面積的比值表示對(duì)應(yīng)抗體相對(duì)表達(dá)含量。

1.7RT-PCR檢測Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) 嚴(yán)格按照Trizol說明書提取各組大鼠腎組織總RNA，分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法測定總RNA的純度和濃度。大鼠Bcl-2引物序列：上游5′-GACGAGAAGTGCTATTGGT-3′，下游5′-TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3′，擴(kuò)增片段為205 bp；Bax引物序列：上游5′-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下游5′-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3′，擴(kuò)增片段為263 bp；β-actin 作為內(nèi)參，上游引物序列：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列：5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，擴(kuò)增片段為452 bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～60℃，30 s；72℃，30 s第二步起循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并攝像，使用Gel Pro Analyzer統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行定量分析，以各組Bcl-2、Bax 吸光度(A)與其對(duì)應(yīng)的β-actin(A)的比值分別表示各組Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組LVEDP顯著升高(P<0.01)，±dp/dtmax明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，TMZ組LVEDP明顯下降(P<0.01)，±dp/dtmax顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2各組腎臟組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠腎小球與腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列整齊；模型組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)排列紊亂，上皮細(xì)胞腫脹、脫落明顯，提示CHF時(shí)腎臟組織有所損害；TMZ組腎小管結(jié)構(gòu)排列整齊，細(xì)胞脫落現(xiàn)象明顯減輕。見圖1。

圖1 各組腎臟組織病理學(xué)觀察(HE，×400)

2.3各組腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)成分是分布于胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒，與假手術(shù)組比較，模型組中Bcl-2表達(dá)明顯減弱，而Bax表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，提示腎組織細(xì)胞凋亡增多；TMZ組與模型組比較，Bcl-2表達(dá)有所增加，而Bax表達(dá)強(qiáng)度減弱(P<0.01)。見表2，圖2。

2.4各組腎臟組織AI 熒光顯微鏡下，被激發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，假手術(shù)組僅有少量細(xì)胞凋亡；與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多(P<0.01)，顯示CHF時(shí)腎臟組織存在大量凋亡細(xì)胞；TMZ組中細(xì)胞凋亡數(shù)量比模型組明顯減少(P<0.01)。見表2，圖3。

2.5各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著下降，Bax mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，TMZ組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著上升，Bax mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表2，圖4，圖5。

表2 各組腎臟組織AI、Bcl-2與Bax蛋白及mRNA表達(dá)比較

圖2 各組腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(DAB，×400)

圖3 各組腎臟組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×200)

M：Marker；1，4：假手術(shù)組；2，5：模型組；3，6：TMZ組；下圖同圖4 各組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)

圖5 各組大鼠腎臟組織Bax mRNA的表達(dá)

3 討 論

研究顯示CHF時(shí)低心排血量、缺氧、神經(jīng)體液的過度激活、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，可以引起腎臟細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腎衰竭〔8，9〕。Schumer等〔10〕指出腎組織缺血可能造成大量細(xì)胞丟失，而該過程與細(xì)胞壞死明顯不同，是由凋亡介導(dǎo)的。

腎臟在受到各種損傷后往往會(huì)發(fā)生腎小管細(xì)胞凋亡，如燒傷，缺血，輻射，創(chuàng)傷或毒性損傷，早期及時(shí)干預(yù)腎臟組織繼發(fā)的細(xì)胞凋亡可能是一個(gè)潛在的保護(hù)途徑〔11〕。在線粒體凋亡通路中，細(xì)胞在Ca2+超載、一氧化氮(NO)、氧自由基大量形成等因素的刺激下，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mPTP)會(huì)開放，使存在于線粒體內(nèi)外膜間隙的細(xì)胞色素C和凋亡因子釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔12〕。mPTP開放有賴于Bcl-2蛋白家族的調(diào)控，Bcl-2蛋白家族主要有抗細(xì)胞凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)和促細(xì)胞凋亡蛋白(如Bax和Bak)，而mPTP是否激活有賴于Bcl-2和Bax蛋白含量的比值，當(dāng)接收到凋亡信號(hào)后Bax將從細(xì)胞質(zhì)易位到線粒體外膜形成大量Bax/Bax同源二聚體，使mPTP開放，導(dǎo)致Cyt-C和凋亡因子釋放〔13〕。而Bcl-2表達(dá)上調(diào)可形成結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異源二聚體，使大量同源二聚體解離，從而抑制細(xì)胞凋亡〔14〕。Bcl-2的過度表達(dá)還可引起細(xì)胞核谷胱甘肽聚集，影響核內(nèi)氧化還原狀態(tài)，阻止胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)，阻斷凋亡進(jìn)程〔15〕。

TMZ對(duì)心臟和腎臟均可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用〔16〕。TMZ對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制主要有：①TMZ可以抑制mPTP開放：TMZ通過增強(qiáng)呼吸鏈中輔酶Ⅰ活性，抑制活性氧自由基(ROS)的生成，繼而減輕線粒體膜的損傷和限制mPTP的開放，從而抑制細(xì)胞色素C的釋放，防止細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔4，5〕。②TMZ可選擇性抑制線粒體長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶，從而減少脂肪酸氧化，促進(jìn)葡萄糖的有氧氧化，維持三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生和缺血細(xì)胞的能量代謝，減少氧化應(yīng)激相關(guān)的游離酸產(chǎn)生的不利影響〔5，17〕。③TMZ能夠減少細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+超載，抑制中性粒細(xì)胞浸潤和氧自由過度生成，具有抗氧化、抗凋亡等多種細(xì)胞保護(hù)作用〔18〕。ROS生成增多將造成線粒體膜電位勢能下降從而導(dǎo)致mPTP開放，引起細(xì)胞凋亡〔19〕。因此，根據(jù)TMZ對(duì)細(xì)胞保護(hù)的相關(guān)作用機(jī)制，它可以通過保護(hù)腎小管缺血上皮細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)能量代謝，降低H+、Na+、Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的聚集，減少氧自由基生成，從而減少細(xì)胞凋亡。

本研究表明TMZ在改善心功能的同時(shí)，可能通過抗氧化應(yīng)激作用抗腎小管細(xì)胞凋亡而改善腎功能。TMZ抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax密切相關(guān)。

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河北省衛(wèi)生計(jì)生委資助課題(No.20110180)

李秀華(1967-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事慢性心力衰竭病理生理研究。

張夢(mèng)云(1988-),女，在讀碩士，主要從事慢性心力衰竭病理生理研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)20-4982-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.012

〔2017-07-16修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)