郭延洪 阿良德 王占鵬 樊海寧

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，青海 西寧 810000)

Apelin13增強(qiáng)大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛效能及對(duì)p38 MAPK和ERK活化的影響

郭延洪 阿良德 王占鵬 樊海寧

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，青海 西寧 810000)

目的探討鞘內(nèi)注射Apelin13(APL)對(duì)大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛效能的影響。方法選取40只雄性健康SD大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管，并隨機(jī)分為對(duì)照組、APL高劑量(APL-H)組、中劑量(APL-M)組及低劑量(APL-L)組(n=10)，APL-H、APL-M及APL-L組分別接受鞘內(nèi)注射10 μl含APL 0.05、0.5、5 μg的MES緩沖液，對(duì)照組鞘內(nèi)注射等體積的MES緩沖液，1次/d，連續(xù)5 d。各組均在鞘內(nèi)給藥前(d0)和給藥后第6天(d6)、7(d7)、8(d8)天皮下注射10 mg/kg嗎啡，測(cè)定各組右后爪的熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL)及甩尾潛伏期(TFL)，并計(jì)算最大可能鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比(MPE)。第8天行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后處死大鼠，采用Western印跡檢測(cè)脊髓腰膨大處的磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)和磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)的表達(dá)。結(jié)果各組d0時(shí)基礎(chǔ)PWTL和TFL的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且對(duì)照組和APL-L組d0、d6、d7、d8時(shí)PWTL、MPE和TFL的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的PWTL、MPE和TFL水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的PWTL、MPE和TFL水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；APL-M組和APL-H組的p-p38 MAPK和p-ERK水平均低于對(duì)照組和APL-L組，且APL-H組該兩種蛋白水平均低于APL-L組和APL-M組(P<0.05)。結(jié)論鞘內(nèi)注射APL可抑制熱痛敏并提高嗎啡鎮(zhèn)痛效能，其機(jī)制可能與抑制p38 MAPK和ERK活化有關(guān)，在恢復(fù)嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效果上有一定價(jià)值。

Apelin13；嗎啡；鎮(zhèn)痛效能；p38絲裂原活化蛋白激酶；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

Apelin是由人體APLN基因合成的含77個(gè)氨基酸的前蛋白原，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后切割成為不同的信號(hào)肽〔1〕，其中Apelin-13(APL)含有13個(gè)氨基酸。Apelin受體在心血管系統(tǒng)中表達(dá)，其在控制水和食物攝入中發(fā)揮重要作用〔2～4〕。近期研究發(fā)現(xiàn)APL具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且可減輕神經(jīng)病理性疼痛〔5，6〕。嗎啡是臨床上常用的麻醉藥物，長(zhǎng)期應(yīng)用嗎啡可導(dǎo)致嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)的下降，出現(xiàn)嗎啡耐受現(xiàn)象〔7〕。但目前APL能否影響嗎啡的鎮(zhèn)痛效能尚未有相關(guān)報(bào)道，故本研究觀察鞘內(nèi)注射外源性APL對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛效能的影響及對(duì)脊髓腰膨大處p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)活化的作用，從而探討APL對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛效能的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 APL購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鹽酸嗎啡注射液購(gòu)自東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，兔抗磷酸化(p)-p38 MAPK抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗p-ERK抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；足底輻射熱痛覺測(cè)試儀，美國(guó)IITC Life Science公司；垂直電泳儀及半干電轉(zhuǎn)移儀，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2動(dòng)物與分組 40只雄性SD大鼠(體重為150～180 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(青)2012-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后行鞘內(nèi)置管并隨機(jī)分為對(duì)照組、APL高劑量(APL-H)組、中劑量(APL-M)組及低劑量(APL-L)組，每組10只。APL-L、APL-M及APL-H組分別接受鞘內(nèi)注射10 μl含APL 0.05、0.5、5 μg的MES緩沖液，對(duì)照組鞘內(nèi)注射等體積的MES緩沖液，1次/d，連續(xù)5 d。本實(shí)驗(yàn)所用大鼠鞘內(nèi)置管及后續(xù)行為學(xué)檢測(cè)期間均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，日光燈明暗交替12 h，室溫22℃～25℃，濕度40%～70%。

1.3鞘內(nèi)置管 經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后，以L5棘突水平為切口中心行背部正中切口，逐層分離直至暴露出L5椎板，將部分棘突鉗除以暴露L5～L6間隙，采用8號(hào)針頭刺破椎間隙的脊髓和韌帶，輕柔地插入PE-10導(dǎo)管，當(dāng)插管深度為1.5～2.0 cm時(shí)經(jīng)皮下隧道固定于頸部，采用10 μl生理鹽水沖管后封管。術(shù)后將每只大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，于術(shù)后6 d經(jīng)導(dǎo)管注射利多卡因，以出現(xiàn)雙后肢麻痹為置管成功。

1.4熱刺激檢測(cè)縮足反應(yīng)潛伏期(PWTL) 各組均在鞘內(nèi)給藥前(d0)和給藥后第6(d6)、7(d7)、8(d8)天皮下注射10 mg/kg嗎啡，測(cè)定各組的右后爪的PWTL：將大鼠置于玻璃板(厚度為3 mm)上至少適應(yīng)30 min后采用熱痛刺激儀光源，焦距通過(guò)玻璃板照射動(dòng)物后肢足底掌心，以開始照射至出現(xiàn)后肢回縮反應(yīng)的時(shí)間為PWTL。為避免損傷，每次照射時(shí)間控制在20 s以內(nèi)。根據(jù)嗎啡處理前及處理后30 min的PWTL數(shù)值計(jì)算最大可能鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比(MPE)，公式：MPE=(鎮(zhèn)痛閾值-基礎(chǔ)閾值)/(最長(zhǎng)照射時(shí)間-基礎(chǔ)閾值)。

1.5甩尾潛伏期(TFL)檢測(cè) 各組均在d0和d6、d7、d8天皮下注射10 mg/kg嗎啡，測(cè)定各組的TFL：將大鼠固定于鼠籠，將尾部約3 cm浸入52℃熱水中，以浸入水中至甩出睡眠的時(shí)間為TFL。

1.6Western印跡檢測(cè) 于第8天行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后處死大鼠，取出脊髓腰膨大處，研磨后加入裂解液裂解，12 000 r/min離心15 min后取上清，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每個(gè)樣本取20 μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離及半干轉(zhuǎn)后，根據(jù)膜面積加入適量p-p38 MAPK和p-ERK一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，采用IPP軟件計(jì)算各條帶的光密度，最終結(jié)果表示為目的條帶與內(nèi)參GAPDH的比值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1APL處理對(duì)基礎(chǔ)PWTL的影響 對(duì)照組及APL處理組d0時(shí)PWTL水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組和APL-L組各時(shí)間點(diǎn)PWTL水平的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的PWTL水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的PWTL水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 APL處理前后的基礎(chǔ)PWTL比較

與d0比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05；下表同

2.2APL處理對(duì)MPE的影響 對(duì)照組及APL處理組d0時(shí)MPE水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組和APL-L組各時(shí)間點(diǎn)MPE水平的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的MPE水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的MPE水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 APL處理前后的MPE比較

2.3APL處理對(duì)基礎(chǔ)TFL的影響 對(duì)照組及APL處理組d0時(shí)TFL水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組和APL-L組各時(shí)間點(diǎn)TFL水平的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的TFL水平均高于d0，且APL-M組和APL-H組d6～d8時(shí)的TFL水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 APL處理前后的基礎(chǔ)TFL比較

2.4APL處理對(duì)p-p38 MAPK和p-ERK水平的影響 對(duì)照組和APL-L組p-p38 MAPK和p-ERK水平的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；APL-M組和APL-H組的p-p38 MAPK和p-ERK水平均低于對(duì)照組和APL-L組，且APL-H組的兩蛋白水平均低于APL-L組和APL-M組(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 APL處理前后p-p38 MAPK和p-ERK水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

A～D：對(duì)照組，APL-L組，APL-M組，APL-H組圖1 各組p-p38 MAPK和p-ERK表達(dá)的免疫組化圖

3 討 論

嗎啡等阿片類藥物是臨床常用的麻醉性鎮(zhèn)痛藥物，長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致耐藥，常見表現(xiàn)為痛覺過(guò)敏、起效時(shí)間縮短及鎮(zhèn)痛效能下降〔8〕，不僅影響了阿片類藥物的應(yīng)用，而且增加了患者的身心負(fù)擔(dān)〔9〕。阿片受體在痛覺傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，新近研究發(fā)現(xiàn)Apelin對(duì)阿片信號(hào)通路有潛在的影響〔10〕。Befort 等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)嗎啡依賴小鼠下丘腦外側(cè)中的 Apelin mRNA水平降低。μ阿片受體激活是導(dǎo)致了Apelin轉(zhuǎn)錄水平下降，且μ阿片受體也介導(dǎo)了APL的鎮(zhèn)痛作用〔12〕，以上表明APL與μ阿片受體的潛在關(guān)系。嗎啡已被廣泛用于治療各種急性疼痛和長(zhǎng)期重度慢性疼痛。然而，有些患者仍未能得到很好的保護(hù)，由于反復(fù)使用后諸如成癮等毒副作用的出現(xiàn)，同時(shí)耐受的產(chǎn)生直接導(dǎo)致療效下降。為提高嗎啡的鎮(zhèn)痛作用，臨床上常嘗試聯(lián)合另一種具有鎮(zhèn)痛作用的藥物〔13〕。

本研究提示APL在一定濃度下可增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛效能，有助于對(duì)改善嗎啡耐受。本研究的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)為APL本身具有較好的鎮(zhèn)痛作用。此外，APL對(duì)增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的效果確切。本研究從另一個(gè)方面也表明APL對(duì)μ阿片受體參與的信號(hào)通路有一定的潛在影響，提示APL可能對(duì)包括嗎啡在內(nèi)阿片類藥物均有較好的鎮(zhèn)痛增強(qiáng)效果。

絲裂原激活的蛋白激酶包括p38 MAPK及ERK等多個(gè)成員，p38 MAPK與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，如周圍神經(jīng)性疼痛時(shí)脊髓中的p38 MAPK表達(dá)顯著升高〔14〕，且抑制p38 MAPK活化可減輕機(jī)械痛敏和熱痛敏癥狀。p38 MAPK及ERK激活在嗎啡耐受時(shí)發(fā)揮了重要作用，如鞘內(nèi)持續(xù)注射p38 MAPK抑制劑可促進(jìn)嗎啡耐受的形成〔15〕，而嗎啡耐受大鼠多個(gè)腦區(qū)和脊髓中ERK激活〔16〕。本研究結(jié)果顯示0.5、5 μg APL處理可降低大鼠的p-p38 MAPK和p-ERK水平，且隨著劑量的升高，兩蛋白磷酸化水平越低，表明APL可限制p38 MAPK和ERK的活化，可能為其發(fā)揮鎮(zhèn)痛效能的方式之一。

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青海省重大科技專項(xiàng)(2016-SF-A5)

樊海寧(1970-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肝膽胰疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

郭延洪(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

R614

A

1005-9202(2017)20-4966-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.005

〔2017-02-15修回〕

(編輯 徐 杰)