黃 穎 姚血明 馬武開 唐 芳

(貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科,貴州 貴陽 550001)

艾拉莫德對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎大鼠關節(jié)滑膜細胞核因子-κB信號的影響

黃 穎 姚血明 馬武開 唐 芳

(貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科,貴州 貴陽 550001)

目的研究艾拉莫德(T-614)對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)模型大鼠核因子(NF)-κB信號的影響。方法將40只大鼠隨機分成空白組，模型組，甲氨蝶呤(MTX)對照組，T-614治療組，每組10只。造模后，采用RT-PCR及Western印跡法檢測T-614對CIA大鼠關節(jié)滑膜細胞NF-κB/P50、NF-κB/P65、IκBα基因及蛋白水平的影響。結果T-614可下調CIA大鼠滑膜細胞NF-κB/P50、NF-κB/P65的表達，上調IκBα的表達，與模型組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；T-614治療組優(yōu)于MTX對照組(P<0.01或P<0.05)。結論T-614可通過降低CIA大鼠關節(jié)滑膜細胞NF-κB/P50、NF-κB/P65表達，升高IκBα表達以達到控制關節(jié)炎的作用。

艾拉莫德(T-614)；Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎；核因子-κB信號

類風濕關節(jié)炎(RA)發(fā)病始動機制至今仍不清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)，核因子(NF)-κB作為炎癥反應的關鍵信號傳導因子，在炎癥細胞因子介導的炎癥反應中起中心作用〔1，2〕，NF-κB信號通路的激活在RA發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔3〕。艾拉莫德(T-614)作為我國完全自主知識產權的具有獨特作用機制的小分子抗風濕藥，相關臨床實驗證實其具有良好療效及安全性〔4〕，現(xiàn)已廣泛應用于RA的臨床治療。甲氨蝶呤(MTX)是一種改善病情的抗風濕藥物(DMARD)，是RA初始治療中的金標準藥物。相較于MTX起效慢、耐藥率逐漸升高，T-614在臨床使用中體現(xiàn)出相應的優(yōu)勢。T-614主要作用機制之一是抗感染作用，本實驗通過建立Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)模型大鼠，研究T-614對 CIA 模型大鼠關節(jié)滑膜細胞NF-κB信號的影響，探討其在治療RA過程中減輕滑膜炎癥的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6周齡40只健康清潔級雌性Wistar大鼠，體重(170±15)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要試劑 牛Ⅱ型膠原(批號C7806-2)、弗氏完全佐劑(批號F5881)，美國Sigma公司；Trizol(批號15596-018)，Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒(批號#K1622)、SYBRGreen/FlouresceinqPCRMasterMix(2×)(批號#K0242)，F(xiàn)ermentas公司；Ex TaqTM(批號DRR100A)、DL2000 DNA Marker (批號D502A)，TAKARA公司；GAPDH抗體(批號AB-P-R 001)，杭州賢至生物有限公司；NF-κB P65抗體(批號8242)，美國CST公司；NF-κB P50抗體(批號ab7971)，abcam公司；IκBα抗體(批號10268-1-AP)、HRP標記羊抗兔二抗(批號BA1054)，武漢三鷹生物技術公司。艾拉莫德片，先聲藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H20110084；MTX，上海信誼藥廠有限公司，批準文號：國藥準字H31020644。

1.3動物分組 將大鼠隨機分為4組，每組10只，①空白組；②模型組；③T-614治療組；④MTX對照組。

1.4模型制備 按照參考文獻〔5〕將牛Ⅱ型膠原溶于0.1%冰醋酸中，按比例與弗氏完全佐劑1∶1充分混和乳化，于Wistar大鼠右后足跖肉墊內注射0.4 ml，第8天以相同乳劑級劑量于大鼠尾根部加強注射?？瞻捉M不予任何處理。

1.5給藥 從造模第1天開始用藥。T-614：10 mg/kg，1次/d，MTX：1 mg/kg，1次/w，給藥時將藥溶于2 ml生理鹽水內?？瞻捉M、模型組均灌胃2 ml生理鹽水。共給藥4 w。

1.6RT-PCR 取-80℃冰箱中保存的細胞，用Trizol法提取總RNA，測定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度，根據(jù)比值估測RNA質量，比值在1.8～2.0滿足實驗要求。將總RNA放于-80℃冰箱內保存以備用。用cDNA第一鏈合成試劑盒，按照試劑盒操作說明，用2.5 μl總RNA合成單鏈cDNA。然后取5 μl cDNA加入20 μl PCR反應體系中進行擴增，置于-20℃保留備用。反應條件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30個循環(huán)；72℃ 4 min。RT-PCR引物序列:β-actin (240 bp)：前向：CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反向：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT；Rat Nfkb(253 bp)：前向：GGCAGCACTCCTTATCAACC，反向：TAGAGGTGTCGTCCCATCGT；Rat IκBα(136 bp)：前向：ATGGCTACCTGGGCATCGTG，反向：TTCAACAGGAGCGAGACCAG。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，反應結束后電腦自動分析計算結果。以β-actin 為內參，每個樣本重復測量3次，以2-△△CT進行分析，取3個樣本測定結果的平均值。

1.7Western印跡法 將滑膜組織加400 μl裂解液進行裂解、勻漿，提取核蛋白，避光孵育后測定OD值，計算樣品蛋白濃度。將樣品蛋白上樣于泳道中，導入電泳液進行電泳，在冰浴中電轉移至PVDF 膜，封閉2 h后，加入PBS浸泡，37℃孵育30 min，加入一抗孵育過夜。充分洗滌后加入二抗孵育2 h。再次充分洗滌后加酶，X線膠片壓片后，顯影、定影。沖洗、晾干、掃描膠片，用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件，計量資料符合正態(tài)分布滿足方差齊性者采用單因素分析，不符合采用非參數(shù)(秩和)檢驗。

2 結 果

2.1T-614對CIA大鼠關節(jié)滑膜細胞NF-κB、IκBα mRNA表達的影響 與空白組相比，模型組NF-κB表達升高(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組NF-κB表達下降(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與空白組相比，模型組IκBα表達下降(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組IκBα表達有不同程度上升(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκBα基因表達

與空白組相比:1)P<0.01；與模型組相比:2)P<0.01；與MTX對照組相比:3)P<0.05

2.2T-614對NF-κB信號蛋白水平的調控 與空白組相比，模型組NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白灰度值明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白灰度比值不同程度下降(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統(tǒng)計學差異(P<0.01或P<0.05)。與空白組相比，模型組IκBα蛋白灰度比值下降(P<0.01)；與模型組相比，T-614治療組IκBα蛋白灰度比值上升(P<0.01)；與MTX對照組相比，T-614治療組具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκBα蛋白表達

與空白對照組相比：1)P<0.01；與模型對照組相比：2)P<0.01；與MTX對照組相比：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

RA是臨床最常見的自身免疫性疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高的特點，嚴重影響人類健康，其發(fā)病與免疫功能異常密切相關〔6，7〕。NF-κB普遍存在于真核細胞內，是介導許多免疫和炎癥反應的中心物質，參與多種相關基因的轉錄調控而發(fā)揮作用〔8，9〕。在RA 的滑膜細胞中，免疫活性NF-κB蛋白P50和P65大量表達，與其調控的細胞因子一起積極參與了關節(jié)炎癥及損傷反應等病理進程，在RA的發(fā)病中起關鍵作用〔10，11〕。當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB與其抑制蛋白IκB形成復合物，以無活性的形式存在于胞質中〔12〕，IκB功能主要是對NF-κB的活化起抑制作用。當細胞受到細胞外信號如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、脂多糖(LPS) 、氧自由基等〔13〕刺激時，可通過降解IκB而激活NF-κB，并很快啟動基因轉錄和蛋白合成〔14〕。活化的NF-κB增強很多炎癥介質，如TNF-α、IL-1β等的表達，而TNF-α、IL-1β等又可進一步激活NF-ΚB的表達，兩者構成正反饋機制，導致RA關節(jié)炎癥及關節(jié)結構破壞得以維持與進展〔15，16〕。因此，阻斷RA患者病理狀態(tài)下NF-κB的活化，可以阻斷疾病的發(fā)展。本課題研究提示，NF-κB可能與CIA模型鼠關節(jié)滑膜炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。T-614是一種新型的具有多作用靶點的緩解病情類藥物，屬甲磺酸苯胺族中的一員，這個家族中大部分成員主要表現(xiàn)為對環(huán)氧化酶(COX)-2的抑制作用，但越來越多的相關研究已證明T-614具備與眾不同的免疫調節(jié)作用。本次實驗發(fā)現(xiàn)T-614及MTX均可下調CIA模型鼠關節(jié)滑膜NF-κB表達，上調抑制蛋白IκBα的表達，在同一時間點，T-614作用優(yōu)于MTX，提示T-614可能通過靶向調控NF-κB信號表達，抑制NF-κB信號通絡的活化，下調相關炎癥細胞因子的水平，從而發(fā)揮治療RA的作用。結合目前對于T-614的諸多臨床研究，對于MTX治療效果不佳或副作用不能耐受的患者，T-614將成為一種更好的選擇。

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TheeffectofT-614〔N-(3-formylamino-4-oxo-6-phenoxy-4H-chromen-7-yl)methanesulfonamideonnuclearfactor-κBsignalofarticularsynovialcellsincollageninducedarthritismodelrats

HUANGYing,YAOXue-Ming,MAWu-Kai,etal.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,theSecondAffiliatedHospitalofGuiyangUniversityofChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China

ObjectiveTo study the effect of T-614〔N-(3-formylamino-4-oxo-6-phenoxy-4H-chromen-7-yl) methanesulfonamide on nuclear factor (NF)-κB signal of articular synovial cells in collagen induced arthritis (CIA) model rats.Methods40 rats were randomly divided into blank control,model control, methotrexate (MTX), T-614 treatment groups, each group with 10 rats.RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of NF-κB/P50, NF-κB/P65, IκBα in each group.ResultsT-614 down-regulated the expressions of NF-κB/P65 and NF-κB/P50,up-regulated the expression of IκBα in articular synovial cells of CIA rats(P<0.01);the effects in T-614 treatment group were better than those of MTX control group(P<0.01 orP<0.05).ConclusionsT-614 could lower the expressions of NF-κB/P50 and NF-κB/P65,upregulate the expression of IκBα in articular synovial cells of CIA rats,through these ways,it could control arthritis.

T-614;Collagen induced arthritis;Nuclear factor-κB signal

國家自然科學基金資助項目(81460727)；貴州省社會攻關項目(黔科合SY字(2013)3048號)；貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字〔2015〕7259號)

姚血明(1984-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合防治風濕免疫病研究。

黃 穎(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合防治風濕免疫病研究。

R6

A

1005-9202(2017)20-4964-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.004

〔2016-11-19修回〕

(編輯 李相軍)