柳常青，王霞，汲生芝，公偉廣，張貴民

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甘精胰島素外源性DNA殘留量的熒光染色法檢測研究

柳常青，王霞，汲生芝，公偉廣，張貴民

273400 臨沂，山東新時代藥業(yè)有限公司（柳常青、王霞、汲生芝、公偉廣）；276006 臨沂，魯南制藥集團股份有限公司（張貴民）

甘精胰島素是一種通過基因工程重組技術，利用大腸桿菌或酵母表達得到的一種重組蛋白類藥物，是具有長效作用的人胰島素類似物。該藥物在皮下注射后立即聚合，溶解度降低，形成微沉淀物，使吸收、分解和作用時間延長，相當于基礎胰島素的無峰值分泌，發(fā)揮長效平穩(wěn)降血糖的作用[1]。宿主細胞殘留 DNA 因有潛在的致癌或傳染風險，是基因工程重組產品需要嚴格控制的雜質。《中國藥典》2015 年版收載了 2 種外源性 DNA 殘留檢測方法：DNA 探針雜交法和熒光染色法。DNA 探針雜交法操作周期較長，干擾因素多，重復性較差，宿主菌 DNA 的種屬和質量直接影響檢測結果的準確性[2]。熒光染色法是利用雙鏈 DNA 熒光染料與雙鏈 DNA 特異結合形成復合物，在波長 480 nm 激發(fā)下產生超強熒光信號，用熒光酶標儀在波長 520 nm 處進行檢測，在一定的 DNA 濃度范圍內以及熒光染料過量的情況下，熒光信號與 DNA 濃度成正比[3-4]。熒光染色法操作簡單快速，不需要宿主 DNA 作為模板，能夠檢測出重組制品中全部 DNA 污染，因而可廣泛用于重組蛋白藥物殘余 DNA 的檢測。

由于熒光試劑盒的緩沖液 pH 值接近甘精胰島素等電點，容易導致樣品溶液渾濁進而影響檢測，同時從相關文獻可知胰島素或其類似物本身可能對熒光法檢測產生干擾[5-6]，本文對甘精胰島素 DNA 檢測的樣品處理方法進行詳細研究，并對檢測方法進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料藥 重組甘精胰島素原料藥由山東新時代藥業(yè)有限公司制備，批號：D012、D013、D020、D022、D033、D034。

1.1.2 儀器 熒光酶標儀 Spectra Max ?Gemini EM 及 SoftMax Pro 軟件為美國 Molecular Devices 公司產品；DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋為天津市泰斯特儀器有限公司產品；Z323K 型高速冷凍離心機為德國 Hermle 公司產品。

1.1.3 實驗試劑 熒光試劑盒 Quant-iTTMPicoGreenTMdsDNA assay kit 購自美國 Invitrogen 公司；PCR 級重組蛋白酶 K 購自瑞士 Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1 供試品的處理方法

1.2.1.1 供試品的直接測定 分別采用 pH 8.5、pH 8.0、pH 7.5、pH 7.0、pH 6.5 的 TE 緩沖液將甘精胰島素配制成 1.0 mg/ml 濃度，同時在上述樣品中加入等體積的10 ng/ml DNA 標準品溶液，制備加樣回收樣品。標準曲線采用同樣 pH 制備和檢測?；厥章视靡韵鹿接嬎悖夯厥章剩?）=（樣品加入 DNA 標準品后的測定值× 2 – 樣品測定值）/加入 DNA 標準品的理論值 × 100%。

1.2.1.2 樣品稀釋法處理 以 1.5 mg 甘精胰島素為 1 劑量計，用 pH 8.5 的 TE 緩沖液分別配制濃度為 1.0、0.5、0.1、0.05 劑量/ml 的樣品溶液，同時在上述樣品中加入等體積的 10 ng/ml DNA 標準品溶液制備加樣回收溶液，測定回收率。

1.2.1.3 飽和苯酚氯仿溶液抽提法 取用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配制的 0.5 劑量/ml 的供試品 450 μl，加入飽和苯酚溶液 450 μl，劇烈振搖混勻，以 10 000 r/min 離心 10 min，轉移上層液體，加入飽和苯酚溶液 450 μl 重復抽提 1 次。轉移上層液體加入三氯甲烷 450 μl，劇烈振搖混勻，以10 000 r/min 離心 10 min，轉移上層液體置通風櫥中敞口放置 15 min 后備用。加樣回收溶液制備：取用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配制的含 0.5 劑量/ml 的供試品及特定濃度的標準 DNA 的溶液 450 μl，同法處理，測定回收率。

1.2.1.4 蛋白酶 K 消化法處理 稱取適量供試品（終濃度分別為 2.0、1.0、0.5、0.1 劑量/ml），加入終濃度為50 μg/ml 的蛋白酶 K 溶液，再用 pH 8.5 的 TE 緩沖液定容至特定體積，混勻后 37 ℃保溫 4 h，作為供試品進行測定。加樣回收溶液制備：稱取適量供試品，加入終濃度為 50 μg/ml 的蛋白酶 K 溶液和 10 ng/ml 的標準 DNA 溶液，再用 pH 8.5 的 TE 緩沖液定容至特定體積，同法處理，測定回收率。

1.2.2 DNA 標準曲線的建立 考慮到樣品處理可能會導致收率偏差，標準曲線制備時，DNA 標準品也按照供試品相應處理方法處理后再進行測定。直接測定和稀釋法測定時：取 DNA 標準品，用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配成 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的標準品溶液。飽和苯酚氯仿溶液抽提：取 DNA 標準品和牛血清白蛋白溶液，用pH 8.5 的 TE 緩沖液配成牛血清白蛋白濃度均為0.8 mg/ml，DNA 標準品濃度分別是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的標準品溶液，分別用上述飽和苯酚氯仿溶液抽提法進行處理。用蛋白酶 K 處理：取 DNA 標準品和牛血清白蛋白溶液，用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配成牛血清白蛋白濃度均為 0.8 mg/ml，DNA 標準品濃度分別是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的標準品溶液，分別用上述蛋白酶 K 消化法進行處理。

1.2.3 測定方法 取各方法處理的供試品溶液、供試品加樣回收溶液、標準品溶液各 400 μl 于 1.5 ml 離心管中，分別加入新配置的雙鏈 DNA 熒光染料 400 μl，混勻后，避光室溫放置 5 min。取 250 μl 上述反應液于 96 孔黑色酶標板中，并做 3 個復孔。用熒光酶標儀在激發(fā)波長 480 nm、發(fā)射波長 520 nm 處測定熒光強度。以各方法處理的 TE 緩沖液作為樣品空白對照。數(shù)據(jù)用SoftMax Pro 軟件進行處理，進行數(shù)據(jù)分析計算。

1.2.4 方法學驗證

1.2.4.1 精密度 供試品濃度為 0.5 劑量/ml，按 40 ng/ml 濃度加入標準 DNA 制備加樣回收樣品。重復性驗證采用一批供試品平行制備 6 份樣品分別測定進行。中間精密度驗證采用 3 批供試品，兩名實驗員在不同日期分別進行4 次測定。

1.2.4.2 不同加樣濃度的加樣回收率 對 0.5 劑量/ml 的供試品濃度分別進行 1.25、2.5、10、40 ng/ml 濃度的標準 DNA 加樣回收率測定。

1.2.4.3 不同供試品濃度的加樣回收率 分別對0.5 劑量/ml、0.2 劑量/ml 和 0.1 劑量/ml 3 個供試品濃度供試品進行 40 ng/ml 的加樣回收率測定。

1.2.5 供試品測定 對 6 批供試品分別進行了兩次重復測定，供試品濃度 0.5 劑量/ml，精密度的回收率測定采用 DNA 標準品濃度為 10 ng/ml。

2 結果

2.1 供試品的直接測定

由于甘精胰島素等電點在 7.0 左右，接近試劑盒中的 TE 緩沖液 pH 值 7.5，會導致樣品渾濁進而可能影響 DNA 檢測。因此，首先對 TE 緩沖液的 pH 值進行確定。結果表明，供試品 1.0 mg/ml 濃度時，在 pH 值低于 8.5 時樣品均有不同程度的渾濁現(xiàn)象，10 ng/ml 的 DNA 標準品加樣回收率 3 次獨立實驗的平均值均低于 85%，RSD 均大于 25%。pH 8.5 時樣品清澈，加樣回收率平均值 119%，RSD 為 15.30%，精密度有所提高但仍偏差較大。

2.2 樣品稀釋法

用 pH 8.5 的 TE 緩沖液將供試品稀釋不同倍數(shù)分別進行測定，實驗重復 3 次，結果見表 1。DNA 標準品加樣濃度 10 ng/ml 時，供試品稀釋后精密度有所提高，但回收率仍超出 80% ~ 115% 限度范圍，無法滿足實驗需求，且供試品濃度越低，DNA 濃度的超標限值越低，準確定量難度越大。因此稀釋法不適合本品的外源性 DNA熒光法測定。

表 1 樣品稀釋法的加樣回收率

注：*三次實驗回收率分別是 108.8%、103.0%、116.7%。

2.3 飽和苯酚氯仿溶液抽提法

0.5 劑量/ml 的供試品加入 10 ng/ml 標準DNA 3 次實驗回收率平均值 82.9%，RSD 為 8.83%。加入 2.5 ng/ml 標準 DNA 3 次實驗回收率平均值 103.9%，RSD 為 18.34%。說明飽和苯酚氯仿溶液抽提法在低濃度 DNA 測定時偏差較大。

2.4 蛋白酶 K 消化法

結果（表 2）顯示，蛋白濃度為 2.0、1.0 劑量/ml 時，酶切完畢時仍有輕度渾濁現(xiàn)象，說明未完全溶解的供試品影響了酶切效果，導致加樣回收率偏差較大。當供試品蛋白濃度在 0.5 劑量/ml 或更低時，樣品清澈，加樣回收率、精密度等均能很好地滿足實驗測定要求。說明供試品中甘精胰島素確實影響熒光法的 DNA 檢測，同時說明本方法采用的 pH 值 8.5 是合適的。

表 2 蛋白酶 K 消化法的加樣回收率

2.5 DNA 標準曲線的建立

標準品 DNA 終濃度分別是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml。以 3 復孔熒光讀數(shù)平均值對 DNA 含量（ng/ml）做標準曲線得回歸方程，見表 3。

表 3 不同處理法的標準曲線方程及線性

實驗結果表明，3 種方法得到的 DNA 標準曲線在 1.25 ~ 80 ng/ml 濃度范圍內2值均符合 2015 年版《中國藥典》中外源性 DNA 檢測熒光染色法的“相關系數(shù)應不低于 0.99”的要求，但飽和苯酚氯仿溶液抽提法線性稍差，且由加樣回收實驗可知在 DNA 低濃度時（2.5 ng/ml）回收率偏差較大。最終采用蛋白酶 K 消化法進行測定，并進行方法學驗證。

2.6 方法學驗證

2.6.1 精密度 對 6 份平行樣品分別進行 40 ng/ml 濃度標準 DNA 加樣回收率測定，結果見表 4。6 次測定加樣回收率平均值為 98.2%，其 RSD 為 1.64%，表明該法的精密度良好，能滿足實驗測定要求。3 復孔讀數(shù) RSD 均小于 5%，表明儀器精密度良好。

不同實驗人員在不同日期分別對 3 批樣品進行 4 次測定，結果見表 5。同一實驗員對同一批次的 4 次測定回收率 RSD 均小于5%，同一批次的不同人員 8 次測定回收率平均值均在 95% ~ 105% 之間，RSD 均小于 5%，方法穩(wěn)定性較好。另外，3 個批次供試品的所有 24 次測定 DNA 含量均低于 1.25 ng/ml，說明供試品 DNA 含量較低。

2.6.2 不同加樣濃度的回收率 測定結果見表 6。在各個加樣濃度下的 3 次實驗加樣回收率平均值均在 80% ~ 115% 之間，RSD 均小于 10%，表明該法能準確測定供試品中 DNA 的殘留量。

2.6.3 不同供試品濃度的回收率 測定結果見表 7。結果表明 3 個供試品濃度加樣回收率均在 80% ~ 115% 之間，RSD 均小于 5%，方法耐用性較好。

表 4 重復性驗證結果

2.7 供試品測定

對 6 個批次的甘精胰島素原料藥分別進行兩次重復測定，結果見表 8。結果表明兩次重復測定結果一致，重現(xiàn)性較好。12 次測定的 10 ng/ml 標準 DNA 回收率均在 80% ~ 115%之間，表明測定結果準確。6 批供試品測定結果均低于 1.25 ng/ml，即供試品中的殘留 DNA 含量均低于 2.5 ng/劑量。

表 5 中間精密度驗證結果

表 6 不同加樣濃度的準確度驗證結果

表 7 不同供試品濃度的準確度驗證結果

表 8 供試品測定的準確度和精密度驗證結果

3 討論

由于甘精胰島素等電點的特殊性及其對外源性 DNA 的熒光法檢測存在干擾，需對試劑盒緩沖液 pH 進行篩選優(yōu)化，且需配制較低濃度的供試品（如 0.5 劑量/ml 及以下）并用蛋白酶 K 處理后進行測定。由于 2015 年版《中國藥典》未對重組甘精胰島素的外源性 DNA 含量做出規(guī)定，參考其重組人胰島素 DNA 殘留量的“每一劑量不得過 10 ng”的限量規(guī)定，在 0.5 劑量/ml 供試品濃度下，DNA 超限濃度為 5 ng/ml。而本法在 DNA 含量 1.25 ~ 80 ng/ml 范圍內線性良好，對超過 2.5 ng/劑量的 DNA 殘留均可以準確定量。

熒光染色法是比較成熟的 DNA 檢測方法，在較寬的 DNA 濃度范圍內線性較好[2-3, 7]。我們后續(xù)對標準曲線進行了 6 次實驗測定，直接測定法和蛋白酶 K 消化法標準曲線2一般在 0.997 以上，與文獻一致。但飽和苯酚氯仿溶液抽提法的2基本在 0.988 ~ 0.995 之間波動（數(shù)據(jù)未列出）。同時，由加樣回收實驗可知，飽和苯酚氯仿溶液抽提法 2.5 ng/ml 標準 DNA 回收率 RSD 為 18.34%，而同樣條件下用蛋白酶 K 處理時回收率 RSD 為 4.1%。推測可能是 DNA 抽提收率差異導致（尤其 DNA 濃度較低時），例如上層水相回收體積的差異，測定前溶液殘留的苯酚和氯仿多少等都可能影響收率，且影響程度難以準確判斷[3,8]。外源性 DNA 屬于微量雜質，檢測時干擾因素多，而蛋白酶 K 消化法是較成熟的樣品處理方法，僅需一步操作，無需對供試品進行 DNA 抽提處理，避免抽提操作帶來的誤差影響檢測結果可靠性。

本文在對甘精胰島素進行蛋白酶 K 處理的基礎上建立了外源性 DNA 殘留量測定方法，并進行了方法學驗證，其線性、準確度、精密度良好，可用于甘精胰島素外源性 DNA 殘留量的測定。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.014

山東省科技重大專項（創(chuàng)新型產業(yè)集群）（2015ZDJQ05001）

張貴民，Email：zhangguimin@lunan.cn

2017-05-31