謝永麗，丁寄葳，岑山，周金明

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PD-1/PD-L1/PD-L2小分子抑制劑的研究進展

謝永麗，丁寄葳，岑山，周金明

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所免疫室

據世界衛(wèi)生組織相關數據顯示，全球每年大約有 880 萬人死于惡性腫瘤，且增長態(tài)勢顯著，對人類健康造成了嚴重的威脅。研究顯示免疫系統(tǒng)在人體自身穩(wěn)態(tài)的維持中起著關鍵性作用，特別是近十年來隨著較多腫瘤免疫藥物被 FDA 批準上市，該療法已成為腫瘤治療領域的焦點。因此，2013 年《科學》將其選為當年“最重要的突破”[1]，2015 年又將腫瘤免疫聯合治療列為“最值得關注的四項科學進展”之一。在腫瘤免疫治療突破性進展中，免疫檢查點抑制劑的發(fā)展最成熟，特別是靶向程序性死亡因子 1 與其配體（PD-1/PD-L1/PD-L2）檢查點蛋白的抑制劑，療效佳且治療腫瘤類型多。因此，本文總結了近些年在腫瘤的免疫治療領域中有關 PD-1/PD-L1/PD-L2 檢查點蛋白抑制劑的研究進展，特別是極具潛力的小分子抑制劑的發(fā)展，為眾多關注該領域的研究者提供依據。

1 免疫檢查點蛋白 PD-1 及其配體 PD-L1/PD-L2 在腫瘤免疫治療中的研究

腫瘤免疫療法通過調節(jié)、激活免疫系統(tǒng)來治療腫瘤，重點在被動免疫治療，即通過外源輸入機體免疫效應物質以調動機體免疫系統(tǒng)來治療疾病[2]，典型的如CAR-T 療法及各檢查點蛋白信號通路抑制劑療法。而從現有臨床藥物的使用上看，檢查點蛋白抑制劑已占據較大市場份額，預計 2023 年將會突破 130 億美元的銷量，成為腫瘤免疫治療中的“明星”藥物[3]。免疫檢查點分子大都屬于 B7/CD28 及 TNF/TNFR 超家族成員，是免疫共刺激或共抑制分子[4]，通過實時協(xié)同調節(jié)淋巴細胞的活性進而影響機體的免疫應答。在機體的免疫調控中，各檢查點分子發(fā)揮復雜的免疫調節(jié)作用，這些分子種類繁多，常見的如PD-1、CTLA-4、IDO、TIM3 等[4]。PD-1 與 CTLA-4 這兩個檢查點蛋白，特別是前者，在目前臨床研究中關注最多，且已在臨床取得成功應用，極大地推動著腫瘤免疫治療的進展。

1.1 免疫檢查點蛋白 PD-1 及其配體 PD-L1/PD-L2 的結構和功能

PD-1，也稱為 CD279，屬于 B7-CD28 受體家族成員[5-6]。PD-1 是一個55 kD 的 I 型表面跨膜糖蛋白受體，由 288 個氨基酸組成[7]（圖 1）。該蛋白包含 4 個結構域，胞外區(qū)為一個 lgV 樣的免疫球蛋白超家族結構域，胞質區(qū)為一由 95 個殘基組成的結構域，還有一由 22 個殘基組成的柄和一跨膜結構域。其中胞質結構域中包含兩種酪氨酸依賴性的免疫受體信號基序，即免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motify，ITIM）與免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motify，ITSM）。與 B7-CD28 其他家族成員不同，PD-1 通常以單體而非同源二聚體形式存在。

PD-1 的兩個配體PD-L1 與 PD-L2，也分別稱為 CD274 與 CD273，兩者先后是由 290 與 270 個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，兩者都屬于 B7 配體家族，有 34% 的同源性。此外兩者有著類似該家族其他成員的共同結構基礎，即其胞外結構域包括兩個并排的結構域，1 個 IgV 樣區(qū)和 1 個 IgC 樣區(qū)，其可直接與 PD-1 結合。PD-L1 或 PD-L2 與 PD-1 結合，受抗原受體信號轉導使得 PD-1 胞質區(qū)兩個酪氨酸信號基序磷酸化，從而激活下游信號途徑，最終破壞 T 細胞的糖代謝及 IL-2 等信號因子的產生，使得 T 細胞喪失免疫功能[8]。此外，PD-L1/PD-L2 共有一段大概由 30 個殘基組成的保守胞內結構域，其功能至今未知[9]。

圖 1 PD-1的基因及其編碼的蛋白質的結構域

與其他 B7-CD28 受體家族成員相比，PD-1 的表達受 T 細胞活性的調控，此外 PD-1 也在 B 細胞、NK 細胞、NKT 細胞以及 DC 細胞中表達[10]。其配體 PD-L1 與 PD-L2 的表達有著很大區(qū)別，PD-L1 在 T 細胞、B 細胞、DC 細胞、巨噬細胞以及非造血細胞等多種細胞中均有表達，而 PD-L2 僅在 B 細胞集中表達，通過細胞因子依賴的方式誘導也可在 DC 細胞、單核細胞、巨噬細胞中部分生成[10]。也正因為 PD-L2 的表達相對 PD-L1 表達所涉及的范圍小，其對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的調節(jié)作用遠不及 PD-L1，因此目前針對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的研究主要集中在 PD-1/PD-L1 相互作用上。

外周組織活化的 T 細胞表達的 PD-1，通過與配體 PD-L1、PD-L2 結合，來抑制 T 細胞的遷移、增殖和炎癥因子的分泌[11-12]。在正常狀態(tài)下，機體憑借 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的負性免疫調節(jié)作用防止免疫系統(tǒng)的過度激活以及保持系統(tǒng)對自身抗原的免疫耐受。但是該信號通路中的檢查點蛋白過表達，就會產生針對 T 細胞受體（TCR）或者 B 細胞受體（BCR）交聯的共抑制信號及促進免疫系統(tǒng)的病理性耐受。在腫瘤微環(huán)境中過表達 PD-L1/PD-L2，均會導致免疫抑制效應的產生[13]，從而使得該條件下的腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，因此能夠快速增殖、轉移[10]。

1.2 PD-1/PD-L1/PD-L2信號通路抑制劑在腫瘤免疫治療中的應用

目前成功用于臨床治療的阻斷 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的藥物主要為抗體藥物，如美國 FDA 在 2014 年 12 月和 9 月分別批準上市的應用于晚期黑色素瘤的納武單抗（nivolumab）[14]和派姆單抗（pembrolizumab）[15]，均是靶向 PD-1 的人源化單克隆抗體。同時，由于檢查點蛋白抑制劑本身并不針對特定的腫瘤細胞，而是針對腫瘤微環(huán)境中的 T 淋巴細胞，這使得 PD-1/PD-L1/PD-L2 檢查點抑制劑的研究向著除黑色素瘤之外的其他實體瘤方向開展[16-18]。如 PD-1 阻斷劑納武單抗與派姆單抗在 2015 年 3 月，被美國 FDA 批準用于晚期或者轉移性非小細胞肺癌的治療。另外，在 2016 年，美國 FDA 又批準上市了用于治療特定類型膀胱癌的靶向 PD-L1 的阿特朱單抗（atezolizumab），另一 PD-L1 抑制劑 durvalumab（MEDI-4736）由 FDA 批準用于治療 PD-L1 陽性轉移性尿路上皮膀胱癌。目前羅氏制藥又嘗試將阿特朱單抗和 durvalumab 用于非小細胞肺癌的治療，且已處于臨床研究階段[19]。此外，用于膀胱轉移性細胞癌或非小細胞肺癌的MPDL3280A 與用于治療非鱗非小細胞肺癌的 BMS-936558，以及其他單克隆抗體如 AMP-514 與 pidilizumab[20]等均進入了臨床研究階段。

同時，靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號途徑的組合型免疫治療藥物的研發(fā)，在近幾年受到更多研發(fā)人員的青睞。已經處于 II 期臨床的 CheckMate-069，就是納武單抗與易普利（ipilimumab）單克隆抗體的聯合體，研究結果顯示，相比于兩單抗的單獨用藥，CheckMate-069 對黑色素瘤有著更好的療效[21]。除了將 PD-1/PD-L1/PD-L2 抑制劑與其他檢查點抑制劑聯合使用之外，將其與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptors，TNFRs）、過繼性 T 細胞治療、腫瘤疫苗以及其他靶向藥物的聯合使用也受到越來越多研究者的重視[22]。如已經有 PD-1 抑制劑與血管內皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor，VEGFR）抑制劑聯用的專利出現[23-25]。

2 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路小分子抑制劑的發(fā)展現狀

雖然靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的單克隆抗體受到高度重視且突破性成果不斷出現，但因其研發(fā)成本昂貴、運輸和貯存條件要求苛刻，加上抗體藥物自身穩(wěn)定性差以及不能口服使得制劑類型受限，此外臨床跟蹤數據顯示部分患者對于該類藥物的治療并不敏感[26]，從而使得最近幾年來，不少研究者將靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2信號通路的抑制劑向著傳統(tǒng)小分子藥物領域拓展，檢查點蛋白小分子抑制劑受到越來越多的關注。目前已經有針對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子抑制劑處于 I 期臨床，如下文將會討論的 CA-170。

靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子抑制劑的發(fā)展落后于單克隆抗體，主要是因為在過去較長的一段時間中，人們對 PD-1 與 PD-L1/PD-L2 蛋白之間相互結合信息的了解較為滯后。但 2008 年 Lázár-Molnár等[27]和 Freeman[28]先后將鼠源 PD-1 與人源 PD-L1 蛋白結合模式信息揭示后，就已經有部分企業(yè)進行了靶向 PD-1/PD-L1 小分子藥物的設計開發(fā)，如美國施貴寶公司于 2015 年報道的靶向該免疫檢查點蛋白的系列小分子抑制劑（圖 2，化合物 1）。該類小分子抑制劑旨在通過阻斷 PD-1 與 PD-L1 的結合，來克服 PD-1/PD-L1 通路的活化所導致的免疫拮抗性疾病，如腫瘤和 HCV 等[29]。均相時間分辨熒光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）實驗顯示，基于該化合物骨架的 9 個化合物均表現出較好的活性，其中以化合物 2 為代表的 A 類化合物的 IC50值可達納摩爾水平[30]。

之后，Zak 等[31]以 BMS202、BMS-8 為模式化合物，闡明了這類小分子抑制劑的作用原理。該研究指出這類小分子抑制劑通過作用于 PD-L1 蛋白表面，引起 PD-L1 形成二聚體，而 BMS202、BMS-8 小分子化合物分別結合于兩個二聚化的 PD-L1 的圓柱形疏水腔中。二聚化后的 PD-L1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用表面與 PD-1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用表面具有高度重合性，導致 PD-1 與 PD-L1 無法產生正常的相互作用從而阻斷該信號通路。

化合物 1 化合物 2化合物 3 化合物 4化合物 5 化合物 6化合物 7 化合物 8化合物 9

值得關注的是，目前已經有抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子化合物處于臨床研究階段，CA-170 就是其中最重要的代表。研究者從 B7 免疫球蛋白超家族成員檢查點蛋白相互作用面的模擬物庫中出發(fā)，篩選得到 CA-170，其作為一種針對 PD-L1、PD-L2 與 VISTA/PD-1H 檢查蛋白信號途徑的口服拮抗劑，目前已經進入了 I 期臨床研究。體外研究發(fā)現，CA-170 對 PD-1/PD-L1/PD-L2 或 VISTA/PD-1H 信號通路均表現出跨種屬拮抗效應，且口服給藥能夠呈劑量依賴性地促進腫瘤浸潤與外周 T 細胞的活力，因而抑制小鼠體內同系腫瘤的生長。但 CA-170 化合物的結構至今未見報道。

2015 年，Sasikumar 等[32]申請了能夠抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子化合物 1,2,4-二唑和 1,2,4-噻重氮的衍生物的專利（圖 2，化合物 3）。研究發(fā)現，這類小分子藥物能夠在骨癌、頭頸癌、胰腺癌等多種癌癥，以及細菌、病毒感染性疾病中有效地抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2信號通路，從而逆轉免疫系統(tǒng)的抑制狀態(tài)。Sasikumar 也是 CA-170 的專利申請人之一。此外，Harvard 等[33]構建了轉基因組成性表達 PD-L1（PD-1c）與PD-L1 基因敲除（PD-1?/?）的小鼠模型，將合成的以磺胺甲氧嗪與磺胺甲二唑（圖 2，化合物4、5）為代表的化合物，在體外利用 PD-1cT 細胞和 PD-1?/?T 細胞進行效能測試。結果發(fā)現此類化合物在 0 ~ 10 mmol/L 的濃度范圍內都有抑制活性，兩者被期待用于糾正機體免疫紊亂所致疾病。

國內目前對于 PD-1/PD-L1/PD-L2 檢查點信號通路小分子抑制劑的研究也逐漸受重視。2016 年 3 月吉林大學研究者發(fā)現，氨基或者二甲基氨基甲酸酯取代的間苯二酚有著抑制 PD-1/PD-L1 信號通路的潛力[34]。他們在Lin 等[35]和 Zak 等[36]報道的 PD-1/PD-L1 復合物結構及 Harvard 等[33]對磺胺甲二唑與磺胺甲氧嗪研究結果的基礎上，以能夠保證V 型結構域完整的間苯二酚和巰基取代的間苯二酚為原料合成了 13 個化合物。之后進行活性篩選得到氨基或者二甲基氨基甲酸酯取代的間苯二酚能夠與 PD-1 結合，從而阻斷 PD-1 與 PD-L1 的結合來發(fā)揮功效，其中活性最高的結構如圖2 化合物 6。

圖 3 人源單體 PD-1 的結構（A）和人源 PD-1（紅色條帶）與人源 PD-L1（藍色條帶）聚合體的結構（B）（與單體 PD-1 相比，聚合體 PD-1 發(fā)生變構，其中 CC' 環(huán)發(fā)生了明顯的重排。黃色條帶表示 62-82 位氨基酸殘基，綠色條帶表示 CC' 環(huán) 70-77 位氨基酸殘基）

另外，分子量介于單克隆抗體和傳統(tǒng)小分子化合物之間的小分子肽類藥物也是近些年的關注熱點之一。Aurigene Discovery Technologies 與 Pierre Fabre 宣布計劃發(fā)展 AUNP-12（圖 2，化合物 7），來抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號途徑以治療癌癥[33, 37-38]{SASIKUMAR, 2013 #40}，該小分子肽目前處于臨床前研究階段[30]。研究表明，AUNP-12 有著較強的抗腫瘤活性，體外實驗顯示其抑制 PD-1 與 PD-L2 結合的 EC50可達 0.72 nmol/L，但是藥代時間較短。因此在該基礎上，研究者進行了進一步的改造，得到了專利 WO 2013/144704（圖 2，化合物 8）、WO 2012/168944（圖 2，化合物 9）報道的化合物，兩者均表現出納摩爾級別的 EC50[30]。

3 PD-1/PD-L1/PD-L2 小分子抑制劑的展望

目前雖然還沒有上市的 PD-1/PD-L1/PD-L2 小分子抑制劑，但是國內外對于PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路小分子抑制劑的研究越發(fā)重視。PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路小分子抑制劑的發(fā)展相對落后于單克隆抗體，主要是由于 PD-1/PD-L1/PD-L2 相互作用信息缺乏。2015 年 10 月，Zak 等[31]初次報道了人類 PD-1 與 PD-L1 蛋白結合復合物的結構信息，即 PD-1 與 PD-L1 蛋白按 1:1 結合形成復合物，兩者之間的相互作用類似于 T 細胞受體與抗體lg V 型區(qū)域的結合，即由蛋白-蛋白相互作用區(qū)域正面的 GFCC'β 折疊片來介導結合[36]。PD-1 在與 PD-L1 結合時，其 Met70-Asp77 處的 CC' 環(huán)將會從遠離結合位點的“開放”狀態(tài)發(fā)生 90° 扭轉從而轉換成“封閉”狀態(tài)，這一變化就使得 PD-1 與 PD-L1 二聚體之間形成了 4 對氫鍵（PD-1 的 Gln75 與 PD-L1 的 Asp26、Arg125 形成 3 對氫鍵、PD-1 的 Thr76 與 PD-L1 的 Tyr123 形成 1 對）（圖 3）。該研究結果為阻斷 PD-1/PD-L1 結合小分子抑制劑的研發(fā)提供了結構生物學基礎。Zak 等[36]還指出人類 PD-L1 蛋白的表面有三個“熱點”。其中 Ile134 與 Ile126 處形成的疏水口袋，能夠分別與六元芳香環(huán)和脂肪烴支鏈結合，被認為是小分子藥物作用的位點。但該研究也顯示，在 PD-1 與 PD-L1 形成二聚體后，其交互界面之間同時存在疏水和極性作用，同時也因為 PD-1 空間構象的變換，其部分殘基繼續(xù)形成氫鍵，這就增加了針對該結合模式的抑制性小分子的設計難度。因此，發(fā)展靶向 PD-1/PD-L1 信號通路的小分子抑制劑可謂“機遇與挑戰(zhàn)并存”。盡管目前還沒有出現成功的針對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號途徑的臨床小分子化學藥物，但是隨著對 PD-1 與其兩個配體之間結合信息的了解的不斷深入，加上理性藥物設計的發(fā)展，定會有更多的活性化合物被不斷發(fā)現。此外，小分子藥物與單克隆抗體的聯用也不斷被嘗試，我們也期待這一手段在將來會更加成熟，以提高現有藥物的療效。

4 總結

綜上所述，PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的阻斷劑在臨床腫瘤免疫治療中取得了令人欣喜的治療效果。雖目前已經成功發(fā)展了針對部分癌癥的單克隆抗體，但其研發(fā)成本高，不穩(wěn)定且有潛在的免疫原性副作用，使得對多肽類和小分子抑制劑，特別是小分子抑制劑的研究受到了越來越多的關注。因為傳統(tǒng)的小分子藥物與抗體藥物相比，有著研發(fā)成本較低、制劑多樣、可口服、較好的腫瘤微環(huán)境滲透作用等諸多優(yōu)勢。同時，PD-1 與其配體 PD-L1/PD-L2 之間相互作用信息以及形成的二聚體表面結合熱點的解讀也越來越深入，這更是為抑制該信號通路的小分子藥物的理性設計提供了重要的結構依據。目前，已經有進入 I 期臨床的 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子抑制劑，如前面提到的 CA-170，更多具有潛在生物活性的化合物處于臨床前研究階段。此外，就腫瘤免疫治療措施本身而言，其所調動的免疫系統(tǒng)中，腫瘤相關性可調控因子與通路眾多，這也為小分子化合物提供了豐富的作用靶標。因此，在有望能夠治愈癌癥的免疫療法中，檢查點蛋白小分子化合物免疫制劑在腫瘤中的應用范圍定會進一步拓展，包括小分子免疫制劑治療癌癥的類型和針對的藥理靶點，從而為腫瘤患者帶來更加光明的治療前景。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.009

國家自然科學基金（81672559、81311120299）

周金明，Email：zhoujinming@imb.pumc.edu.cn；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2017-06-05